精氨酸酶在双孢蘑菇子实体采后贮藏品质调控中的作用

孟德梅 张亚璇 杨 瑞 樊振川 申 琳 生吉萍

（1 省部共建食品营养与安全国家重点实验室 天津科技大学食品工程与生物技术学院 天津300457 2 大健康生物技术国际联合研究中心 天津300457 3 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083 4 中国人民大学农业与农村发展学院 北京100872）

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）作为一种营养价值丰富的食用菌，受到国内外越来越多消费者的喜爱，是世界上栽培最多，产量最大，销售最广的食用菌[1]。然而，双孢蘑菇仍以鲜销为主，且其自身具有呼吸强度旺盛和含水量高的特点，导致子实体采后极易失水、开伞和发生褐变，严重影响了双孢蘑菇的食用品质和经济价值[2]。目前我国食用菌保鲜大多采用低温、气调、辐射、化学等几种保鲜方法[3-4]，虽然有一定的保鲜效果，但存在成本高，能耗高，存在化学残留，商业化程度低的问题。研究影响双孢蘑菇采后贮藏品质的内在重要因素，并施以针对性地调控，对于双孢蘑菇及同类型食用菌的贮藏保鲜具有科学和应用价值。

精氨酸是生物体内功能最丰富的氨基酸之一，在动植物体内的生理功能已受到广泛重视[5-6]。多项研究发现，精氨酸除作为氮素贮藏营养外，它还在小麦[7]、平邑甜茶[8]、番茄[9-10]等植物的抗逆过程中起重要的调节作用。此外，精氨酸代谢还与果蔬采后的贮藏品质，如蜜橘果实的黄化[11]，青花菜营养物质的流失和采后的衰老[12]有密切关系。精氨酸酶被认为是双孢蘑菇鸟氨酸循环中的重要酶之一[13]，其编码基因（GenBank Accession NO.AJ640140）目前已被克隆。然而，与植物相比，精氨酸酶在食用菌中的生理功能，尤其在食用菌采后贮藏品质中的作用还未见报道。本研究首次采用特异性精氨酸酶抑制剂Nω-羟基-nor-L-精氨酸（nor-NOHA）处理的方法，来抑制子实体内精氨酸酶活性，进而研究精氨酸酶在双孢蘑菇采后贮藏品质调控中的作用，以期为开发新型双孢蘑菇保鲜方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

双孢蘑菇（菌株编号A15）子实体，江苏裕灌现代农业科技有限公司；选择直径为3～3.5 cm，大小均匀，无病虫害，无损伤的子实体；将子实体分成两组（试验组与对照组），每组120 个，每组再随机分成3 份，用于3 个重复试验。

精氨酸酶抑制剂Nω-羟基-nor-L-精氨酸（nor-NOHA），纯度≥97%，德国Merck 公司；α-异亚硝基苯丙酮、L-精氨酸，纯度≥98%，美国Sigma公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫代巴比妥酸、甲醇、Tris 等（均为国产分析纯级），蓝弋试剂公司。

1.2 处理方法

试验组双孢蘑菇置于终浓度20 μmol/L 的精氨酸酶抑制剂溶液中浸泡处理2 min，浸泡结束后用纱布吸干水分，自然晾干后放于聚乙烯塑料筐中，用保鲜膜覆盖，置于温度为（4±1） ℃、湿度为85%～90%环境贮藏21 d。对照组子实体采用蒸馏水浸泡处理，其它条件同试验组。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 开伞率 开伞是指采后双孢蘑菇在后熟阶段菌柄、菌褶继续生长，导致菌膜破裂的一种现象。开伞率的计算采用Jiang 等[14]的方法。

开伞率（%）=（Noc/Nt）×100

式中，Noc——开伞的蘑菇数；Nt——蘑菇总数。

1.3.2 酶活的测定 SOD、CAT 和PPO 酶液的提取均采用pH 7.0 的50 mmol/L 磷酸盐缓冲液，酶活力分别采用货号为A001-1，A007-1，A136 的南京建成试剂盒测定。SOD 活性以每毫克组织蛋白在1 mL 反应液中SOD 抑制率达50%时所对应的SOD 量为一个SOD 活力单位（U）；CAT 活性以每克（鲜重）双孢蘑菇每秒钟分解1 μmol 的H2O2的量为一个活力单位；PPO 活性以每分钟每克组织在1 mL 反应体系中在波长525 nm 处吸光度值变化0.01 为一个酶活力单位。

1.3.3 可溶性蛋白含量的测定 可溶性蛋白的提取缓冲液为pH 7.0 的50 mmol/L 磷酸盐缓冲液，可溶性蛋白含量测定采用货号为A045-2 的南京建成试剂盒进行。

1.3.4 MDA 含量的测定 MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸法[15]。

1.3.5 总酚和类黄酮含量的测定 总酚和类黄酮含量的测定采用分光光度法[15-16]。

1.3.6 精氨酸酶活性的测定 参考Zhang 等[17]的方法对双孢蘑菇果实精氨酸酶的活性进行测定，并加以修改。取1 g 冷冻样品，加入2 mL 预冷的提取缓冲液 【100 mmol/L Tris-HCl （pH 7.5），含1%（体积分数）β-巯基乙醇，0.l mmol/L PMSF】，冰浴研磨，于4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，上清即为酶提取液。酶溶液先用1 mmol/L MnCl2在37℃下激活10 min。0.5 mL 反应体系，含40 μL 酶液，100 mmol/L Gly-NaOH 缓冲液 （pH 9.5），250 mmol/L 精氨酸，2 mmol/L MnC12，33 μmol/L 尿素酶抑制剂对苯二酚，37 ℃下水浴反应20 min，加入500 μL 的15%（体积分数）高氯酸（PCA）终止反应。取200 μL 反应液，加入3 mL 酸混合液（体积分数9%的磷酸和体积分数27%的硫酸），充分混合，然后加入100 μL 用95%乙醇溶解3%（质量分数）的α-异亚硝基苯丙酮。混合液在沸水浴中避光反应60 min，快速冷却后检测波长540 nm 处的吸光值。以不同浓度的尿素溶液制作标准曲线，酶活性以每分钟每克鲜重生成尿素的量表示。

1.4 数据统计分析

用Excel 2010 软件分析所有数据，计算标准偏差并制图。应用SPSS 17.0 软件对所有数据进行方差分析（ANOVA），利用邓肯多重比较法对数据进行差异显著分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间精氨酸酶活性的影响

为明确精氨酸酶在采后双孢蘑菇贮藏保鲜过程中的重要作用，首先研究贮藏期间双孢蘑菇子实体中精氨酸酶活性的变化规律。由图1所示，对照组中精氨酸酶活性呈先逐渐增加后减小的变化趋势，在14 d 达到最大值，为36.4 μmol/mg·min。虽然精氨酸酶抑制剂处理组子实体中精氨酸酶活性与对照组呈相似的变化规律，但是在整个贮藏过程中其精氨酸酶活性均显著低于对照组 （P＜0.05），尤其贮藏至14 d 时，精氨酸酶活性仅为对照组的47.6%。结果说明，采用精氨酸酶抑制剂nor-NOHA 处理可有效抑制子实体中精氨酸酶的活性。

2.2 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间开伞率的影响

开伞是双孢蘑菇从成熟走向衰老的重要感官指标。在贮藏过程中（图2），无论是精氨酸酶抑制剂处理组还是对照组的双孢蘑菇，其子实体均从第3 天开始破膜开伞，且随着贮藏时间的增加，开伞率均呈快速增长趋势。贮藏第3 天，试验组和对照组的开伞率均仅为6%左右，无显著性差异（P＞0.05）。然而，随贮藏时间的延长，精氨酸酶抑制剂处理组的子实体开伞率始终显著高于对照组（P＜0.05），为对照组的1.23～1.56 倍，说明抑制双孢蘑菇中精氨酸酶的活性后明显加速了子实体采后贮藏中的开伞进程。

图1 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间精氨酸酶活性的影响Fig.1 Effect of nor-NOHA treatment on the arginase activity of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

图2 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间开伞率的影响Fig.2 Effect of nor-NOHA treatment on the cap opening percentage of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

2.3 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间抗氧化酶活性的影响

CAT 和SOD 两种抗氧化酶，在生物体内的活性氧（如过氧化氢和超氧阴离子）清除方面发挥着重要作用[18]。由图3a 所示，在前14 d 的贮藏中，精氨酸酶抑制剂处理组和对照组中的CAT 活性变化趋势基本一致，均呈先增加后下降继而趋于平缓的趋势；虽然两组CAT 活性均在第1 天达到峰值水平，但精氨酸酶抑制剂处理显著降低了CAT的峰值水平（P＜0.05），由对照组的5.9 U/g FW 降至3.16 U/g FW；尤其贮藏14 d 后，精氨酸酶抑制剂处理组的CAT 活性呈急剧下降的趋势，而对照组的CAT 活性呈上升状态。同样从图3b 可以看出，除了第1 天两组样品中SOD 水平无显著性差异外，精氨酸酶抑制剂处理显著抑制了整个贮藏过程中SOD 水平的上升（P＜0.05），尤其在贮藏7 d 后精氨酸酶抑制剂处理组中SOD 水平降低的尤为显著，贮藏至第14 天时，对照组SOD 活性已达精氨酸酶抑制剂处理组的1.49 倍。以上试验结果说明，抑制双孢蘑菇中精氨酸酶的活性不利于采后贮藏过程中子实体内抗氧化相关酶活力的维持或改善。

2.4 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间褐变相关酶活性的影响

褐变是导致双孢蘑菇感官品质降低的重要影响因素之一，而多酚氧化酶（PPO）是引起双孢蘑菇酶促褐变反应的关键酶，其活性的高低直接决定双孢蘑菇的白度。图4结果显示，精氨酸酶抑制剂处理组和对照组中PPO 活性在采后贮藏期间均呈现先下降后上升的变化趋势。对照组中的PPO 活性在前14 d 贮藏过程中逐渐降低，直至21 d 时上升至最高水平（22.08 U/g FW）；而精氨酸酶抑制剂处理组PPO 活性仅在贮藏1 d 内有所下降，随后即逐渐上升，7～14 d 时快速上升，至14 d时就到达峰值水平（22.6 U/g FW），说明精氨酸酶抑制剂处理加速了双孢蘑菇采后贮藏中PPO 活性高峰的到来。而且，在贮藏后期精氨酸酶抑制剂处理组中PPO 整体水平显著高于对照组 （P＜0.05），在贮藏14 d 时达到了对照组的4.7 倍。以上结果表明，抑制双孢蘑菇体内精氨酸酶活性后加快了子实体采后贮藏中的褐变速率。

2.5 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间膜脂过氧化产物含量的影响

MDA 含量的高低是反应果蔬采后贮藏过程中膜脂过氧化程度的重要指标。由图5显示，两组子实体中的MDA 含量在整个贮藏过程中均呈逐渐增加的趋势，说明双孢蘑菇在采后贮藏过程中膜脂过氧化程度逐渐升高。MDA 含量在贮藏前期仅为1.67 μmol/g FW，贮藏21 d 后增加至3.8 μmol/g FW 左右，为贮藏前的2.28 倍。而且，精氨酸酶抑制剂组MDA 含量整个贮藏期始终显著高于对照组（P<0.05），为对照组的1.2 倍左右。说明抑制精氨酸酶活性后加快了子实体采后膜脂过氧化程度的进程。

图3 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间CAT（a）和SOD（b）活性的影响Fig.3 Effect of nor-NOHA treatment on the activities of CAT （a） and SOD （b） of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

图4 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间PPO 活性的影响Fig.4 Effect of nor-NOHA treatment on the PPO activity of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

图5 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间MDA 含量的影响Fig.5 Effect of nor-NOHA treatment on the MDA content of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

2.6 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体贮藏期间抗氧化相关物质含量的影响

双孢蘑菇中富含多酚、类黄酮等重要抗氧化物质，具有较高的抗氧化能力[19]。图6为贮藏过程中子实体内总酚和类黄酮含量的变化趋势图。从图6a 可以看出，两组子实体中总酚含量在贮藏期间变化幅度不大，呈先上升后下降最后缓慢上升的变化趋势，且除贮藏第3 天时，精氨酸酶抑制剂处理组子实体中总酚含量显著低于对照组（P<0.05）外，两组子实体中多酚含量并没有显著性差异。由图6b 可知，在整个贮藏过程中，两组子实体中类黄酮含量呈现持续增长的趋势，在贮藏前两组子实体中类黄酮含量仅为0.15 OD325/g FW，贮藏21 d 后，精氨酸酶抑制剂处理组和对照组子实体中类黄酮含量分别达到0.45，0.6 OD325/g FW。而且，在整个21 d 的贮藏期间，精氨酸酶抑制剂处理组子实体中类黄酮含量均显著低于对照组（P<0.05）。以上结果说明抑制双孢蘑菇中精氨酸酶的活性不利于子实体采后贮藏中总酚和类黄酮物质的积累，进而可能对子实体自身抗氧化水平产生一定影响。

图6 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间总酚（a）和类黄酮（b）含量的影响Fig.6 Effect of nor-NOHA treatment on the contents of total phenol （a） and flavonoid （b） of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

2.7 精氨酸酶抑制剂处理对双孢菇子实体采后贮藏期间可溶性蛋白含量的影响

图7 精氨酸酶抑制剂处理对双孢蘑菇子实体采后贮藏期间可溶性蛋白含量的影响Fig.7 Effect of nor-NOHA treatment on the soluble protein content of postharvest A.bisporus fruiting bodies during storage

刚采摘的双孢蘑菇在贮藏过程中，体内的蛋白质被分解为氨基酸，用于供给能量，促进子实体的继续膨胀，菌柄、菌褶的生长[20]。从图7可见，两组双孢蘑菇子实体中可溶性蛋白的含量在贮藏1 d 内均急剧减少，仅为处理前的50%左右，未呈现显著性差异（P>0.05）。随后，两组处理中的可溶性蛋白含量变化幅度不大，整体呈缓慢下降的趋势，而精氨酸酶抑制剂处理组子实体内可溶性蛋白的含量在贮藏3 d 和14 d 时显著高于对照组 （P<0.05），说明精氨酸酶抑制剂在抑制精氨酸酶活性的同时，可能也抑制了其它蛋白酶的活性，从而降低了子实体采后贮藏中蛋白质的分解速度。

3 讨论与结论

精氨酸酶是精氨酸代谢中的关键酶之一，其活性高低直接影响精氨酸代谢产物包括多胺、脯氨酸、尿素、鸟氨酸等物质在生物细胞中的水平，在多种基本的代谢过程中发挥重要调控作用[21-22]。精氨酸酶抑制剂nor-NOHA 是动物研究领域的重大发现[23-24]，可以与酶活性中心的Mn2+簇作用，特异性抑制精氨酸酶的活性，目前在动植物精氨酸酶的功能研究中得到了广泛的应用[24-25]。然而，目前精氨酸酶与食用菌采后生理功能和贮藏品质关系的研究尚未见报道。本研究以食用菌研究领域的典型模式材料-双孢蘑菇作为试验材料，借鉴动植物中的研究方法，首次利用nor-NOHA 抑制双孢蘑菇中的精氨酸酶活性，来研究精氨酸酶在调控子实体采后贮藏品质中的作用。

研究结果表明，采用20 μmol/L nor-NOHA处理可以很好的抑制双孢蘑菇子实体内精氨酸酶的活性，这与Zhang 等[26]在番茄果实中的研究结果一致，说明精氨酸酶的活性中心在生物体中具有良好的保守性。此外，结果显示抑制双孢蘑菇中的精氨酸酶活性后，子实体在采后贮藏过程中的CAT 和SOD 活性显著降低，总酚和类黄酮含量积累降低、膜脂过氧化产物MDA 含量持续增加并显著高于对照组（P<0.05），这意味着精氨酸酶活性与采后双孢蘑菇清除活性氧的能力和衰老程度有密切关系。Zhang 等[26]结果同样证明了nor-NOHA处理后显著抑制了番茄果实体内的抗氧化酶活性，促进了MDA 积累。Khalil 等[7]也发现精氨酸酶活性的升高与小麦苗在高温胁迫下体内SOD 和CAT 活性的提高，MDA 积累的下降有关。这些均与本试验结果一致。

褐变是导致双孢蘑菇感官品质降低的一个非常重要的因素[2]，而PPO 酶活力与双孢蘑菇的褐变程度显著正相关（相关系数达0.9857）[27]，被认为是引起双孢蘑菇子实体褐变的重要酶。结果显示nor-NOHA 处理显著刺激了子实体贮藏期内PPO 活性的增加（P<0.05），说明精氨酸酶活的降低加速了子实体采后的褐变进程。除褐变外，开伞是表征双孢蘑菇形态质量的另一个重要参数[28]，也是区别于植物性果蔬的一个重要品质指标。采后贮藏过程中，双孢蘑菇会继续发育直至衰老，表现为菌膜破裂，菌褶逐渐扩张，菌柄逐渐伸长，最终成熟菌褶暴露，释放出孢子。这种由采后继续发育导致的开伞过程，最终导致子实体中的营养物质，如糖类发生迁移或缺乏，引起感官品质的下降[28]。本试验的结果表明，nor-NOHA 处理后子实体的开伞率在整个贮藏期间均显著高于对照组（P<0.05），表明精氨酸酶活的降低同样加速了子实体采后的开伞进程。与以上结果不同，精氨酸酶抑制剂处理后，双孢蘑菇中可溶性蛋白含量在贮藏中的下降速率减慢。推测可能是因为nor-NOHA 除抑制精氨酸酶活性之外，同时还抑制了其它蛋白酶的活性，从而表现为采后贮藏中可溶性蛋白分解成氨基酸的速率下降。田长恩等[23]试验结果显示，抑制精氨酸酶活后，甜瓜子叶内可溶性蛋白含量呈现与本试验有类似的变化趋势，而精氨酸酶抑制剂处理对之无显著影响。

综上结果表明，20 μmol/L nor-NOHA 处理显著降低了整个贮藏过程中双孢蘑菇中的精氨酸酶活性，同时显著抑制了子实体中抗氧化能力相关的酶活（SOD 和CAT）及抗氧化物质（多酚和类黄酮）的积累，加速了子实体贮藏中的开伞和褐变进程，加重了子实体的膜脂过氧化程度，从而加速了双孢蘑菇采后贮藏中品质的下降速率。