冰敷与热敷分别联合推拿对家兔急性骨骼肌损伤修复作用的比较

李应志， 张吉， 邵长丽， 邰先桃， 王春林， 艾健

（1.云南中医药大学，云南昆明 650500；2.云南中医药大学附属云南省中医医院，云南昆明 650500）

在运动损伤中，35%～55%是软组织损伤[1]。一般认为，急性损伤后的24 h内不可以热敷，只能冰敷[2]，冰敷可以消肿止痛[3]，热敷会加重肿胀[4]。也有研究认为，冰敷虽然会减少炎症反应[5，6]，但同时也会减慢损伤组织的修复速度[7]。中医传统外治疗法中没有冰敷的概念，多强调热敷疗法。但是不论是冰敷还是热敷，关于两者的作用原理都缺少可靠的实验证据，为此本课题组设计了动物实验，以探究冰敷、热敷在急性骨骼肌损伤后的应用效应及机理，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 30只6月龄雄性新西兰家兔，体质量（2.66±0.21）kg，由昆明楚商科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK（滇）K2018-0001。家兔常规分笼饲养，每笼2只，均以标准啮齿动物饲料喂养，自由饮水。室温保持在20～25℃，相对湿度50%～55%，光照及黑暗的环境各12 h。

1.2 试剂与仪器 总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；TaKaRa PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa公司，批号：DRR036A）；TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司，批号：DRR820A）。Thermo NanoDrop超微量核酸蛋白检测仪（美国Thermo Scientific公司）；Veriti型ABI PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；MX3000P型安捷伦核酸扩增荧光检测仪（美国安捷伦公司）；RM2245半自动轮转式切片机（德国Leica公司）。

1.3 动物分组与造模 将30只新西兰家兔随机分为空白组、损伤对照组、冰敷+推拿组、热敷+推拿组、推拿组等5组，每组6只。除空白组外，其他各组家兔均造成急性骨骼肌损伤模型。参照胡军等[8]的家兔骨骼肌钝挫伤模型方法，本研究进行了改良。具体操作方法：将家兔右下肢腓肠肌的肌腹处用8%硫化钠脱毛剂脱毛后，固定在兔盒内，再将右下肢固定在造模打击台上，在家兔腓肠肌最高点处用记号笔标记“+”号，用重力锤对准标记从高处自由落体造成打击伤。打击物质量为500 g，下落高度为50 cm，连续打击3次。为减少误差，所有造模均由同一人完成。

1.4 干预方法 为尽量保证手法的统一性，参与手法干预的人员为1名有10年工作经验的推拿医生，采取分批造模和取材。

1.4.1 冰敷+推拿组 伤后立刻行冰敷治疗：将碎冰块包在密封塑料袋内，置于受伤的软组织局部，5 min后拿去，共敷3 d。第3天冰敷后开始推拿治疗：先用按揉法作用于家兔委中穴1 min，而后在损伤的部位按揉法操作10 min。自第4天起，该组家兔只进行推拿干预，不再使用冰敷疗法。推拿治疗为每天1次，推拿至第13天。

1.4.2 热敷+推拿组 伤后立刻行热敷治疗：将毛巾放在智能调温煮水器中，温度调到50℃，煮2 min，用镊子拿出后拧干水分，将其置于家兔受伤部位，持续敷100 s，拿去该热敷巾，立刻换上新的热敷巾，以同样方法重复操作3次，共计5 min。热敷共3 d。第3天热敷后紧接着开始做推拿干预治疗，推拿干预手法同冰敷+推拿组，推拿至第13天。

1.4.3 推拿组 伤后72 h，在损伤的部位用按揉法操作10 min，每天1次，推拿至第13天。

1.4.4 损伤对照组 伤后不做任何手法治疗，每天测量家兔体质量、肿胀度，到第14天取材。

1.4.5 空白组 不做任何干预，饲养14 d后取材。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 测量肿胀度 钝挫伤后1～3 d，在做冰敷或热敷之前（第1天即伤后30 min，第2、3天于相同时间），用细软皮尺以“+”号为中心绕其一周测量，记录周长读数。做完冰敷或热敷后，再次测量同一部位周长。肿胀度=冰敷或热敷前下肢周长-冰敷或热敷后下肢周长。为了尽量减少测量误差，共测量3次取平均值。

1.5.2 体质量与腓肠肌湿质量比 取材前用电子称称取家兔体质量。而后经耳缘静脉注入10 mL空气致栓塞死亡后即刻取损伤侧腓肠肌，在电子称上称取质量并记录。把腓肠肌受伤最明显处作为最佳取材部位，取约黄豆大小2块，一块放入体积分数10%中性福尔马林溶液中固定，另一块放入冻存管密封后放进液氮罐。待所有家兔取材完成后统一对样本进行测试。

1.5.3 腓肠肌组织病理 将腓肠肌组织修切成小块放入体积分数10%中性福尔马林溶液中固定，然后进行包埋、切片、苏木素—伊红（HE）染色，显微镜下观察腓肠肌组织病理变化。

1.5.4 逆转录实时定量PCR（RT-PCR）法检测胰岛素样生长因子1（IGF-1）和成肌调节因子（MyoD）mRNA表达 称取适量腓肠肌组织，加入1 mL TRIZOL试剂冰上匀浆后，按照总RNA提取试剂盒说明书方法进行操作。总RNA提取完后，于超微量核酸蛋白检测仪测定所提取RNA的浓度、纯度[显示D（260 nm）/D（280 nm）在 1.8～2.0 之间]。取总 RNA 1 μg，按照TaKaRa公司RT-reagent逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。反应体系为PrimeScript RT Master Mix 2 μL，500 ng样本对应的总RNA体积，加ddH2O至10 μL，反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。按TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq荧光定量试剂说明书进行荧光定量PCR反应，以SYBR Green为荧光标记物，β-actin为内参对照。取2 μL cDNA加入20 μL反应体系进行扩增，反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，Primer F 1 μL。Primer R 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s；62℃20 s。共40个循环。扩增反应结束后关闭仪器，分析数据。MYOD1引物序列：上游，5’-CTCCGAGACGTGGACTTGA-3’；下游，5’-CAGA TCCGAGGAGTCGAAAC-3’。 扩 增 长 度 99 bp。IGF-1引物序列：上游，5’-ATTTCAACAAGCCC ACAGGA-3’；下游，5’-GCCTCCTCAGATCACAG CTC-3’。扩增长度99 bp。GAPDH引物序列：上游，5’-CTCCTGCGACTTCAACAGTG-3’；下游，5’-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3’。扩增长度99 bp。扩增反应完成后，结果采用相对定量法2-ΔΔCt，计算各基因相对表达量（p）。

1.6 统计方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析（one way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模结果 造模后的家兔下肢均肿胀明显，皮下有明显瘀青。第2天任取1只，经耳缘静脉注入空气栓塞处死后即刻取材，经HE染色处理后，结果显示，和正常家兔腓肠肌组织比较，造模组家兔有明显的肌纤维断裂、肿胀，间质中渗出大量红细胞、炎症细胞，部分肌丝破坏损伤，炎症细胞浸润。表明造模成功。结果见图1。

2.2 冰敷、热敷家兔第1～3天下肢肿胀度比较 造模后的1～3 d，结果显示：冰敷家兔第1天下肢肿胀度较热敷组、损伤对照组增加（P＜0.05），第2、3天下肢肿胀度与其他2组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。热敷家兔第1天下肢肿胀度无变化，第2、3天肿胀度稍增加，但与其他2组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。表明冰敷在损伤早期的确有消肿的作用，热敷则没有加重损伤早期骨骼肌的肿胀度。

图1 伤后第2天家兔腓肠肌组织病理变化（HE染色，×20）Figure 1 The changes of the pathological features of rabbit gastrocnemius tissues on the second day after injury（by HE staining，×20）

表1 冰敷、热敷第1～3天家兔下肢肿胀度比较Table 1 Comparison of the swelling degrees of rabbit lower limbs during 1-3 day（s）of ice compress and hot compress （±s，l/mm）

表1 冰敷、热敷第1～3天家兔下肢肿胀度比较Table 1 Comparison of the swelling degrees of rabbit lower limbs during 1-3 day（s）of ice compress and hot compress （±s，l/mm）

①P＜0.05，与损伤对照组比较；②P＜0.05，与热敷+推拿组比较

第3天0.0±0.0 0.2±0.1 0.1±0.0组别损伤对照组冰敷+推拿组热敷+推拿组N666第1天0.0±0.0 0.8± 0.0①②0.0±0.0第2天0.0±0.0 0.0±0.0 0.1±0.1

2.3 各组家兔体质量与腓肠肌湿质量比 该比值可反映腓肠肌后期恢复情况，比值越小说明腓肠肌恢复得越好。表2结果显示：与推拿组比较，热敷+推拿组体质量与腓肠肌湿质量比减小，差异有统计学意义（P＜0.05）；与空白组比较，损伤对照组、推拿组、冰敷+推拿组、热敷+推拿组体质量与腓肠肌湿质量比均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示单纯的推拿、冰敷+推拿疗法在恢复肌质量方面无明显优势，热敷联合推拿对腓肠肌质量较其他组更有一定的积极作用。

表2 各组家兔第14天体质量与腓肠肌湿质量比的比较Table 2 Comparison of the ratio of body mass to wet mass of gastrocnemius muscles in various groups on the fourteenth day （±s）

表2 各组家兔第14天体质量与腓肠肌湿质量比的比较Table 2 Comparison of the ratio of body mass to wet mass of gastrocnemius muscles in various groups on the fourteenth day （±s）

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，与推拿组比较

体质量与腓肠肌湿质量比136.547±3.608 169.225±10.521①184.542±6.510①181.490±28.648①165.805± 11.573①②组别空白组损伤对照组推拿组冰敷+推拿组热敷+推拿组N66666

2.4 各组家兔腓肠肌病理变化比较 治疗后第14天取各组家兔腓肠肌组织，经HE染色，结果显示：损伤对照组可见肌纤维明显萎缩、坏死，肌纤维间隙变宽，炎症反应强烈；冰敷+推拿组亦可见肌纤维明显萎缩、坏死，肌纤维间隙变宽及强烈炎症反应，但可见明显的新生血管生成。热敷+推拿组肌纤维明显恢复，肌纤维排列紧密整齐；推拿组肌纤维间可见明显的结缔组织填充。见图2。表明热敷联合推拿的方法较冷敷联合推拿及单纯的推拿更有利于家兔腓肠肌钝挫伤的恢复。

图2 各组家兔腓肠肌病理变化比较（HE染色，×20）Figure 2 Comparison of the pathological features of rabbit gastrocnemius tissues in various groups（by HE staining，×20）

2.5 各组家兔第14天IGF-1、MyoD mRNA表达量比较 表3结果显示：热敷+推拿组IGF-1 mRNA表达水平较其他各组明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。热敷+推拿组MyoD mRNA表达水平高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；热敷+推拿组MyoD mRNA表达水平高于推拿组和冰敷+推拿组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。表明热敷联合推拿法在促伤后骨骼肌修复过程中IGF-1 mRNA、MyoD mRNA表达上有一定的优势，提示这种方法促进钝挫伤骨骼肌的修复可能优于冰敷+推拿组、单纯推拿组。

表3 各组家兔第14天IGF-1、MyoD mRNA表达量比较Table 3 Comparison of the mRNA expression levels of IGF-1 and MyoD in various groups on the fourteenth day （±s）

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，与损伤对照组比较；③P＜0.05，与推拿组比较；④P＜0.05，与冰敷+推拿组比较

MyoD mRNA 0.485±0.303 0.831±0.390 1.083±0.858 1.183±0.493 2.579±0.959①组别空白组损伤对照组推拿组冰敷+推拿组热敷+推拿组N66666 IGF-1 mRNA 0.208±0.0471 0.823±0.468 1.571±1.111 2.373±1.876 4.846 ± 2.373①②③④

3 讨论

本研究结果发现：急性期损伤后30 min，冰敷可以起到消肿作用，但是经冰敷后的家兔在后期恢复过程中无明显优势。急性骨骼肌损伤后热敷治疗没有加重家兔下肢的肿胀程度，在后期恢复中似乎更利于软组织的修复。另外，本课题组在干预过程中发现，经冰敷后的家兔腓肠肌内硬块较多，取材时发现多为变性的软组织。

冰敷疗法在软组织损伤方面被广泛应用。一般认为，冰敷可以消肿止痛[9]，可以降低皮肤温度[10]，减少组织损伤后带来的炎症反应[11]；但是对于该疗法缺少强有力的证据[12]。Fullam等[13]对29位踝扭伤患者进行冰敷疗法治疗前后进行星形探足平衡测试，结果显示冰敷后踝关节稳定性变差。Sloan等[14]观察接受冰敷和非冰敷疗法的2组急性踝扭伤患者，在肿胀消除方面没有明显的区别。Laba等[15]也得到了同样的结论。Coté等[16]则认为冰敷在改善肿胀方面比热敷有优势。Basur等[17]观察到冰敷联合加压包扎对踝关节扭伤的消肿作用优于单纯加压包扎。Hocutt等[18]分别用冰敷和热敷用于36 h内踝扭伤的患者，发现冰敷组恢复功能的时间约为13.2 d，而热敷组平均约为33.3 d。Takagi等[7]研究发现冰敷会延缓骨骼肌修复，会造成胶原蛋白合成增多。但Vieira Ramos等[19]通过对大鼠胫骨前肌造成类似打击伤，发现冰敷疗法可以消除肿胀。在本实验中，家兔在损伤后30 min开始出现明显的肿胀，此时分别用热敷和冰敷疗法，证明在伤后30 min冰敷有利于伤后下肢的消肿，但24 h后冰敷和热敷对改善软组织的肿胀度没有差别；而从第14天各组HE染色病理结果可见，冰敷+推拿组促进骨骼肌修复作用弱于热敷+推拿组。有研究指出，冰敷的作用机制是通过降低皮肤温度，减少组织液渗出等来达到消肿作用[20]。但从干预过程中观察发现，冰敷后家兔伤肢肌肉内硬结明显多于其他各组，在后期取材中发现这些组织变性为结缔组织，这说明冰敷疗法对促进组织的炎性物质代谢吸收可能不利。Takagi等[7]研究亦发现，冰敷后的损伤肌肉内，胶原蛋白沉积多于非冰敷组，肌纤维的直径也较非冰敷组细，生长因子TGF-β1和IGF-I的表达也滞后于非冰敷组1～2 d，提示冰敷会减慢软组织的恢复速度。

推拿对骨骼肌损伤修复和运动后肌肉疲劳的恢复都有很大帮助[21]，这也是本研究选择手法作为后期干预的原因。相关研究表明，治疗运动创伤的方法大概有65种，其中使用最多而且疗效又好的为手法治疗，占34%，居于首位，总有效率为76.5%[22]。在骨骼肌急性钝挫伤后，超早期推拿可增加膜修复蛋白dysferlin的表达，促进破裂的肌细胞膜及时修复，可能有利于损伤肌细胞的修复，从而帮助受损的骨骼肌修复[23]。推拿能影响人骨骼肌细胞中钙离子的信号通路，从而激发损伤细胞修复的生物学效应[24]。本研究中，单纯的推拿也可以较好地改善家兔下肢肿胀，但推拿联合热敷或冷敷疗法对家兔骨骼肌的修复作用较单纯的手法更有优势。

MyoD是成肌调节因子家族中的成员之一，在胚胎发育过程中决定着干细胞向肌细胞方向定向分化。损伤后的骨骼肌再生与修复都受MyoD影响，而MyoD参与骨骼肌的激活和分化。MyoD现在被认为是作为主要的肌生成控制器，在由KAP1磷酸化介导的开/关转换关联中起作用。有研究表明，冰敷疗法与损伤对照组相比，并不能改变骨骼肌中MyoD的表达[19]。本研究中，热敷+推拿组在促MyoD生成方面优于冰敷+推拿组，表明在组织修复方面，热敷可能优于冰敷，这提示冰敷在提高骨骼肌的MyoD mRNA表达方面没有优势，而传统的热敷疗法可能会增加MyoD基因表达。

IGF-1主要作为内分泌激素以旁分泌/自分泌方式在靶组织中产生，IGF-1可调节细胞生长和发育，特别是在神经细胞中，促进细胞DNA合成[25]。IGF-1是单链多肽，由70个氨基酸组成，它在骨骼肌发育阶段高水平表达，而在成熟骨骼肌中的表达水平却很低，对细胞分化、增殖和个体生长发育起着重要的促进作用。IGF-1能增加骨骼肌的血液供应，促进骨骼肌蛋白合成，抑制肌动蛋白分解。肌肉损伤可引起IGF-1 mRNA的表达水平应激性增加，研究认为，IGF-1通过激活卫星细胞促进肌肉再生，阻止肌肉功能损伤，并对骨骼肌损伤修复起加速作用[26]。Takagi等[7]研究发现，冰敷会造成骨骼肌当中生长因子（TGF）-1和IGF-I的表达滞后1～2 d。本研究中，冰敷+推拿组家兔的IGF-1的mRNA表达低于热敷+推拿组，表明与传统的热敷相比，冰敷+推拿组在促进IGF-1 mRNA的表达上没有优势，其他各组的IGF-1 mRNA表达也低于热敷组，这提示早期热敷可能会对软组织肿胀的远期恢复有益。

综上所述，本研究结果提示在软组织钝挫伤的早期，冰敷减轻软组织肿胀的疗效是可靠的，在后期的组织恢复上并没有明显的优势。因此，在针对软组织的急性钝挫伤后，先冰敷后热敷后结合推拿治疗可能是比较好的治疗方案，相关的作用机制还要结合实验研究来深入探索。