外源蛋白对污水及再生水处理过程中生物膜形成促进机制研究

陈从立 周奕含 崔晓春 王建伟

摘 要 污水及再生水中所含有的微生物在一定条件下会形成生物膜， 从而增加了再生水后续利用的难度。本研究以牛血清蛋白（Bovine serum albumin， BSA）为模式蛋白， 埃希氏大肠杆菌为模式菌， 通过检测不同蛋白质浓度下大肠杆菌所形成的生物膜含量， 分析了外源蛋白对生物膜形成的影响， 通过FTIR及XPS深入探究了其中的作用机制。结果表明， 生物膜中的生物量随蛋白浓度的提高而增加。加入8.0 mg/L蛋白质可使菌悬液中微生物的Zeta电位值下降约35%;添加外源蛋白可使微生物的疏水性增强;蛋白质的官能团与菌体表面的官能团相互作用提高了微生物的聚集性， 并刺激了微生物胞外多糖的生成。本研究为污废水处理及再生水利用过程中生物膜形成及控制方面提供了重要的理论依据。

关键词 生物膜; 外源蛋白; 溶解性微生物产物; 疏水性; 胞外多糖

1 引 言

在现代水处理工艺中， 生物处理技术已广泛应用于市政污水和工业废水的处理。利用生物处理技术使水体中化学需氧量（Chemical oxygen demand，  COD）、氨氮、悬浮固体等常规水质指标达标的同时， 常忽略出水中残留的溶解性微生物产物（Soluble microbial products， SMPs）。SMPs主要是由蛋白质、多聚糖以及腐殖酸等物质组成， 这些物质主要来源于未被充分降解的天然有机物和微生物死亡后的胞内溶出物[1～3]。研究表明， SMPs的存在对污水及再生水处理工艺造成了严重的负面影响， 如引起膜污染，以及污水再生过程中产生消毒副产物[1，4]。

蛋白质作为SMPs的重要组成成分之一， 在现有的二级处理工艺出水中的浓度为3～12 mg/L[5，6]。二级出水中的残余溶解性微生物蛋白通常不易被微生物降解利用， 而污水深度处理如强化混凝等传统的再生工艺很难将其去除[6]， 在水环境中可长期存在[5]。这类蛋白质分子量主要分布在<0.5 kDa和>50 kDa两个区域[7]。大分子量的蛋白质很难被生物降解， 这类大分子蛋白质与目前报道的生物絮凝剂具有极大的相似性， 因此可通过吸附架桥和网捕卷扫作用，使水体中悬浮颗粒和胶体粒子有效地团聚[8，9]。在污废水生化处理工艺的出水中共存着大量微生物和溶解性微生物蛋白质， 这些蛋白质的存在可能会促进微生物细胞的聚集。深入探究这类蛋白对微生物的作用对污水处理下游工艺的有效运行和水环境保护具有重要意义。然而， 目前关于该类外源难降解微生物蛋白对微生物影响的研究还鲜见报道。

目前已有的研究结果表明， 内源性蛋白通过减弱胞体间的静电斥力、增强胞体表面的疏水性等作用使微生物相互聚集[10～12]， 因此， 可以推测， 生物处理工艺出水中残余的溶解性微生物蛋白作为外源蛋白同样可以影响微生物的聚集，并通过物理化学作用促进生物膜的形成。本研究以污水处理中常用的模式蛋白和微生物为研究对象， 考察了外源蛋白对微生物形成生物膜的影响， 并通过对生物膜的微观结构观察、生物膜生物量的测定，以及生物膜性质的表征和分析， 深入探究了外源蛋白促进微生物成膜的作用机制。

2 实验方法

2.1 仪器与试剂

CKX41倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）; RT-6000酶标仪（中国Rayto生命科学分析技术有限责任公司）; TGL-16K离心机（湘仪实验室仪器发展有限公司）; Pilot1-2冷冻干燥机（博医康实验有限公司）; MalvernNano-ZS90电位测定仪（英国马尔文仪器有限公司）; JC2000C接触角测定仪（上海中晨数字技术设备有限公司）。

LB培养基（Luria broth LB 北京奥博星生物科技有限责任公司）; 甲醇，乙醇，HCl，H2SO4，NaOH（分析纯，北京化工厂）; 结晶紫（纯度>99%，河北三顺教学仪器有限公司）; 苯酚（纯度>99%，天津大茂化学试剂厂）。

2.2 模式微生物和模式外源蛋白的选择

选用大肠杆菌为目标微生物， 采用纯菌体系培养生物膜， 大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922， 广州工业微生物检测中心）是生活中常见的微生物之一， 也是污水处理厂出水中的代表性细菌， 被广泛作为培养生物膜的模式微生物。

二级出水中所含蛋白质具有分子量大、生物降解性差的特点。本研究选取牛血清白蛋白（Bovine serum albumin， BSA， Sigma 9048-46-8 USA， 纯度>98%）为模式蛋白。BSA由607个氨基酸组成， 分子量约为66 kD， 其分子表面含有亲疏水基团而具有一定的表面活性， 等电点4.7， 难以被微生物降解， 是一种常用于研究水质及水质净化的模式蛋白质[13，14]。

培養基选取无机盐培养基： 葡萄糖 0.563 g/L， NH4Cl 0.385 g/L， K2HPO4·3H2O 0.04 g/L， KH2PO4 0.023 g/L， MgSO4 0.012 g/L， CaCl2 0.03 g/L（分析纯， 北京化工厂）和1 mL微量元素A5溶液。

2.3 实验方法

2.3.1 大肠杆菌的复壮及培养基的配制 大肠杆菌接种于肉汤培养基（Luria broth， LB）中， 37℃振荡培养过夜。取细菌悬液在8000 r/min转速下离心10 min， 菌体沉淀用20 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS， pH=7.2）重悬， 并重复清洗3次， 以去除细菌表面的培养基。将菌体重悬于20 mmol/L PBS溶液中， 调节其OD600=0.5， 作为细菌贮存液（细菌细胞的浓度～108 CFU/mL）。配制80 mg/L BSA蛋白质贮存液。向无机盐培养基中添加不同体积的蛋白质贮存液， 使蛋白浓度分别达到0、 2.0、 4.0和8.0 mg/L。

2.3.2 生物膜的培养 使用24孔和96孔细胞培养板进行生物膜培养， 其中24孔孔板内放置灭菌后的玻璃爬片。将细菌细胞的贮存液与含有不同浓度蛋白的无机盐培养基按照1%（V/V）的比例加入孔板中。24孔板每孔加入体积为2 mL， 96孔板每孔加入体积为200 μL。将微孔板放置于恒温振荡培养箱中（37℃， 90 r/min）培养。

2.3.3 生物膜的显微镜表征 将24孔板中培养8 和48 h的生物膜爬片取出， 用20 mmol/L PBS （pH 7.2）溶液清洗3次， 以去除爬片表面松散附着的细菌细胞和培养基基质， 然后用0.1% 结晶紫对细胞爬片进行染色5 min。染色完成后， 将爬片放置在载玻片上， 使用倒置显微镜进行观察。

2.3.4 生物膜的定量分析 使用结晶紫染色法对培养好的生物膜进行定量测定[15]。生物膜培养完成后， 移去细胞悬液。向每孔中加入200 μL 99% 甲醇， 对生物膜进行固定， 15 min后将甲醇吸出， 并将孔板倒置晾干。每孔加入200 μL 0.1% 结晶紫溶液， 对生物膜进行染色5 min。用20 mmol/L PBS溶液（pH 7.2）清洗5次， 并将孔板倒置晾干。向每孔中加入160 μL 95% 乙醇， 将生物膜上的染色剂溶解下来， 将其中的100 μL溶液转移到新的孔板中。使用酶标仪对溶解下来的结晶紫在570 nm条件下进行检测， 以对生物膜的形成进行定量分析。每个实验条件重复10个微孔。

2.3.5 Zeta电位测量 用超纯水稀释细菌储存液至～107 CFU/mL， 然后加入适量蛋白质贮存溶液， 使蛋白质浓度达到0～8.0 mg/L。在不同浓度蛋白质下， 检测细菌细胞的Zeta电位。

2.3.6 接触角测定 根据2.3.1节的方法配制含有不同蛋白浓度（0＼， 2.0＼， 4.0和8.0 mg/L）的无机盐培养基菌悬液， 使用接触角测定仪自动获取相同体积的菌悬液， 缓慢提升载体玻璃片与菌悬液接触， 测定接触角， 每个浓度条件重复测定6次。

2.3.7 光谱分析的样品制备 从24孔板的5个孔中将培养了48 h的生物膜刮下， 并收集在20 mL 超纯水中， 在8000 r/min下离心10 min， 弃去上清液， 将沉淀物在80℃条件下冷冻干燥24 h， 对得到的干燥生物质进行X-射线光电子能谱及傅里叶变换红外光谱表征。

2.3.8 胞外多糖的测定 收集培养好的生物膜， 使用20 mmol/L PBS（pH=7.2）清洗3次， 在4℃下， 3000 r/min离心10 min。固体重悬于去离子水中， 30℃水浴孵育60 min。在4℃下， 12000 r/min离心30 min， 获得胞外聚合物提取液。胞外多聚糖使用苯酚-浓硫酸法测定[15，16]。

3 结果与讨论

3.1 外源蛋白对生物膜形成效果的影响

在4个浓度（0、2.0、4.0和8.0 mg/L）的外源蛋白培养基培养8和48 h的微生物生物膜， 经结晶紫染色显微镜观察结果见图1。在相同培养时间下， 随着蛋白质溶液浓度的提高， 载体表面的微生物聚集的数量和体积均增大， 表明生物膜的形成效果随蛋白质浓度的提高而逐渐增强， 蛋白质促进了微生物生物膜的形成。

为进一步验证生物膜形成效果， 将载体表面紧密附着的生物膜用结晶紫进行染色， 经甲醇洗脱后，测定相同面积载体表面上的生物量， 结果如图2所示，培养8和48 h的生物膜中生物量的变化趋势一致， 即随着蛋白浓度提高， 形成的生物膜的量逐渐增多。

3.2 外源蛋白促进微生物生物膜形成的机理

3.2.1 外源蛋白对微生物聚集和沉降的影响 BSA作为一种生物大分子， 其空间结构及表面电性随溶液pH值的变化而变化， 从而影响了菌悬液中微生物及胶体分子的Zeta電位[17，18]。Zeta电位易通过电化学方法测定， 可定量反映固相表面的荷电状态[19]， 其数值与胶态分散的稳定性相关， 是对颗粒之间相互排斥或吸引力强度的度量。Zeta电位的绝对值越高， 体系越稳定， 即颗粒在溶液中分散， 不易凝聚。

反之， Zeta电位越低， 越倾向于凝聚。Zeta电位测定结果显示， 随着pH值增高， 不同浓度BSA菌悬液中微生物的Zeta电位值持续降低（图3）。如图3中圆圈标识所示， 添加不同浓度蛋白质溶液， 将pH值维持在6.9～7.0之间。添加4.0和8.0 mg/L的蛋白质溶液的Zeta电位绝对值比不添加蛋白质的对照组溶液Zeta电位绝对值降低约35%， 与Xie等[2]的研究结果趋势一致。根据Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek（DLVO）理论可知， Zeta电位绝对值的降低说明BSA的加入使得溶液中微生物-微生物、微生物-BSA间的静电斥力减小， 微生物与蛋白质分子间易相互聚集， 形成复合物， 进而促进初始生物膜的形成。

3.2.2 外源蛋白对微生物细胞疏水性的影响 测定了含有不同浓度蛋白质的菌悬液与载体表面的接触角（图4）， 结果表明， 当溶液中不添加蛋白质时， 菌悬液与载体表面的接触角为41.2°; 随着蛋白质浓度提高， 接触角变小， 当添加蛋白浓度为8.0 mg/L时， 接触角减小至16.7°。

上述结果说明， BSA的添加显著增强了BSA-微生物的疏水性， 微生物更易在载体表面附着， 促进了生物膜的初步形成。这是因为BSA与微生物自分泌的内源性胞外蛋白类似， 其分子具有多种疏水性氨基酸残基， 如苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等， 使其具备稳定的三维结构[20]。当BSA与微生物共存时，二者间的相互作用可能使蛋白质的构象发生变化， 蛋白内部的疏水性基团更多地暴露于环境中， 引起BSA-微生物的疏水性增强[21，22]。另外， 当蛋白质分子中非极性部分与菌表面的非极性部分周围均有有序排列的水分子存在， 且二者接近到一定程度时， 由于空间的减小， 会将有序的水分子排挤出来， 从而发生水合现象， 加剧蛋白与微生物的结合与沉降。

3.2.3 BSA与微生物間的键合作用 为探究外源蛋白的加入对形成生物膜组分的影响， 分别对单纯BSA及有无外源BSA添加形成的生物膜进行傅里叶红外光谱分析（图5）。结果表明， 不加BSA的细菌形成的生物膜与BSA的红外谱图相似， 差异较小。当添加8.0 mg/L蛋白质后， 归属于酰胺I带α-螺旋的1648 cm1偏移至1641 cm1， 归属于酰胺II带的1544 cm1明显地偏移至1558 cm1， 这种偏移主要是由蛋白质分子中酰基CONH的CN伸缩振荡导致的[22]。类似的， 当添加蛋白质后， 归属于BSA酰胺III带的β-折叠结构的子峰1240/1241 cm1偏移至无规卷曲结构的子峰1257 cm1， 整个谱图的峰呈现出高波数的峰蓝移、低波数的峰红移的变化。 α-螺旋和β-折叠的迁移以及无规卷曲结构的出现均说明BSA与微生物的相互作用使蛋白质构象发生了变化[23，24]。与纯生物膜组的谱图相比， 加入BSA后， 生物膜多糖成分中的COC（1078 cm1）偏移至1098 cm1， 且在1041 cm1出现一个新峰， 此峰是由多聚糖分子中C-H键伸缩形变产生[25]。说明外源蛋白的存在引起生物膜中胞外聚合物的变化， 尤其是多聚糖的种类和含量。 因此， 当外源蛋白存在时， 微生物和蛋白质的相互作用引起蛋白质构象发生变化， 增强了微生物的疏水性， 使得生物膜中胞外聚合物的组分发生改变， 多糖含量增加。

X射线光电子能谱（XPS）表征结果（图6）进一步说明了BSA与微生物间的键合作用对生物膜形成的影响。未添加外源蛋白形成生物膜的C1s能谱中含有283.80 （±0.5）、 285.12 （±0.3）和 287.61 eV的峰， 分别对应C（C，H）、C（O，N）和CO[12，26]（图6A）。如图6B所示， 当添加8.0 mg/L BSA培养生物膜时，CO的峰面积由3.6%增长至17.1%。结合傅里叶变换红外光谱表征结果， 推测外源蛋白参与了生物膜的形成， 并刺激多聚糖的产生。

3.2.4 外源蛋白对生物膜中胞外多糖产生量的影响 生物膜由微生物细胞和胞外聚合物组成， 而蛋白质和多糖是胞外聚合物的主要成分，

多糖含量的变化与生物膜的性质密切相关[29]。为进一步验证FTIR以及XPS的结果， 测定了不同条件下培养的生物膜中的多糖含量（图7）。结果表明， 当添加0、2.0、4.0和8.0 mg/L的外源蛋白时， 单位质量生物膜中的胞外多糖的质量分别为0.89＼， 1.01＼， 1.18和1.27 mg。 胞外多糖的含量随着蛋白浓度的提高而增加。因此， 添加低浓度的外源蛋白可以显著增强微生物多糖的分泌。多糖含量的增加有利于微生物粘附在载体表面， 增强微生物间的凝聚; 同时， 多糖含量的增加对保持生物膜结构的稳定发挥了重要作用[30]。因此， 外源蛋白的添加可以刺激多糖含量的生成， 促使生物膜的稳定和成熟。

4 结 论

研究表明， 外源蛋白可以提高微生物细胞的疏水性， 使微生物更易附着于载体表面， 为初始生物膜的成熟提供了稳定的基础。外源蛋白与细胞表面丰富官能团的相互作用减弱了微生物的亲水性，加强了细胞的絮集。此外， 外源蛋白可通过刺激胞外多聚糖的分泌促进生物膜的成熟。 污水处理厂出水中残余的溶解性微生物蛋白在污水后续的运输和再生过程中会增加生物膜的污染， 进而造成不利的影响。因此， 亟需对出水中的溶解性微生物蛋白进行有效去除及控制。

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