液相色谱-高分辨质谱结合蛋白质组学技术分析曲妥珠单抗耐药胃癌细胞的转录因子

常晋霞 汪宜 张帆 刘文虎

摘 要 采用基于液相色谱-高分辨质谱的转录因子结合序列串联多拷贝双联DNA结合元件（Concatenated tandem array of transcription factor response elements， catTFRE） Pull down蛋白质组学技术，研究了曲妥珠单抗耐药胃癌细胞的转录因子及其调控作用。以合成的串联转录因子结合序列DNA片段为亲和试剂，用生物素标记，作为“DNA诱饵”，通过Pull down富集后，采用液相色谱-高分辨质谱检测捕获的转录因子，基于强度定量法（Intensity based absolute quantification， iBAQ）定量，筛选出与DNA结合活性显著变化的转录因子。利用WebGestalt （2017）数据库对激活转录因子调控的信号通路、家族分类、调控网络及转录因子-靶基因（TFs-targets）进行分析。结果表明， 359个转录因子被定量检测，与亲本细胞相比，61个转录因子在曲妥珠单抗耐药胃癌细胞中与DNA结合活性显著变化，其中结合活性增强48个，活性降低13个。激活转录因子属于bZIP、bHLH、homebox、HMG box、Zine finger等家族。KEGG通路富集显示，癌症、MAPK、Wnt、TGF-β、凋亡等多条通路在耐药细胞中显著改变。TFs-targets分析表明，TCF7L2、TCF7、FOXC1、JUN、CYC、FOS、ELK4、NFκB2、DDIT3和ATF2在上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transformation， EMT）、Wnt、MAPK信号通路促使胃癌曲妥珠单抗耐药过程中发挥重要调控作用，提示靶向这些转录因子所调控的信号通路可能是逆转胃癌曲妥珠单抗耐药的重要途径。

关键词 曲妥珠单抗; 耐药性; 转录因子结合序列串联多拷贝双联DNA结合元件; Pull down; 蛋白质组学

1 引 言

胃癌的发病率、死亡率在所有恶性肿瘤中位居前列，由于缺乏早期诊断手段，超过70%的患者确诊时已有转移或进入中晚期[1]。曲妥珠单抗为靶向HER-2的单克隆抗体药物，通过拮抗HER-2信号转导及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用发挥作用，用于HER-2过表达转移性乳腺癌和胃癌的治疗[2]。尽管曲妥珠单抗疗效确切，然而肿瘤获得性耐药已成为影响其有效治疗的重要问题[3]。因此，研究胃癌曲妥珠单抗耐药机制，对阐明逆转耐药机理，增强肿瘤化疗敏感性具有重要意义。

近年来，基于质谱的蛋白质组学高通量分析方法得到快速发展，为阐明疾病的发病机理提供了技术条件[4～6]。转录因子作为调控基因表达的蛋白质，在肿瘤增殖、转移及耐药过程中发挥着重要作用[7]。对转录因子的定量分析研究是阐明其生物功能、揭示转录调控机制的首要条件，然而由于转录因子的丰度极低，因此给其检测和定量带来了极大困难。尽管mRNA测序、染色质免疫共沉淀结合高通量测序（ChIP-Seq）等技术被用于转录因子在mRNA水平的定量及转录因子与DNA结合的动态研究，然而由于mRNA与蛋白质表达的相关性仅30%，因此以mRNA推测转录因子的表达的准确性并不高[8]; 而ChIP-Seq对抗体的特异性要求高，容易出现假阳性或假阴性结果[9]。Ding等[10]开发了一种深度检测转录因子与DNA结合活性的技术，合成了包含100种不同类型转录因子结合序列的串联多拷贝DNA结合元件，用生物素标记后包装成“DNA诱饵”，采用Pull down策略富集核内转录因子，利用蛋白/肽段分级分离联合质谱技术对捕获的转录因子进行深度分析，解决了转录因子定量检测的难题，为低丰度蛋白质的定量分析提供了新策略。

在本研究组的前期研究中[11，12]，基于蛋白质组学技术研究了曲妥珠单抗耐药胃癌细胞蛋白质表达谱，发现多条信号通路激活与耐药相关，在此基础上探究了逆转胃癌曲妥珠单抗耐药的可能策略[13]。本研究以曲妥珠单抗敏感细胞NCI N87和耐药细胞NCI N87/R为研究对象，利用基于质谱的蛋白质组学技术结合catTFRE pull down策略，从转录调控角度探究曲妥珠单抗耐药胃癌细胞NCI N87/R的转录因子，通过生物信息学手段对激活转录因子调控的信号通路、作用网络、家族分类及转录因子-靶基因调控关系进行分析，为胃癌曲妥珠单抗耐药机制研究提供了科学依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Q-Exactive Plus质谱仪和Easy-nLC 1000 nano液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）; VCX500型SONICS多功能超声仪（美国Sonics公司）; HS-3垂直混合仪（宁波新芝生物公司）; GL-802B微型真空泵（海门其林贝尔仪器公司）; 5810R型真空浓缩仪（德国Eppendorf公司）; DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器公司）; CKX31型光学显微镜（日本Olympus公司）; LRH-70生化培养箱（上海一恒科学仪器公司）。

NCI N87和NCI N87/R细胞由军事医学科学院施明教授惠赠。注射用曲妥珠单抗（上海罗氏制药有限公司，规格440 mg，批号S20060026）; 胎牛血清（FBS， 美国Gibco公司）; DMEM培养基和胰酶（美国Mediatech公司）; 双抗（含100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素，北京鈕英泰克生物技术有限公司）; pGEX4T2-catTFRE重组质粒（上海Sigma公司合成）; Biotin标记的catTFRE引物（华大基因合成，引物5′用biotin标记，正向引物：5′-CCCAGTCACGTAGCGATAGC-3′，反向引物：3′-CGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAG-5′）; DNA聚合酶、DNA Ladder、DL2000 DNA ladder（日本TakaRa公司）; Pure Plasmid Mini Kit、Gel extraction kit、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（北京康为世纪生物有限公司）; NE-PER核蛋白提取试剂盒、DynabeadsTM M-280 Streptavidin亲和磁珠（美国Thermo Fisher公司）; 胰酶（美国Promega公司）; 抗体c-Jun（9165）、JunB （3753）、c-Myc（5605）和GAPDH（5174） （美国Cell Signaling Technology公司）; NaHCO3、NaOH（分析纯，美国Sigma公司）; 甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、纯水（HPLC级，美国Thermo Fisher公司）; NETN、BC-0、2×DNA Binding Buffer、1×DNA Binding Buffer、BC-150、BC-200、50×TAE和Destain脱色液（自制）。

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养 亲代细胞NCI N87和耐药细胞NCI N87/R采用DMEM （加10% FBS和1%双抗）培养基， 在5% CO2、37℃培养箱中培养，细胞传代2～3次后进行实验。为保持耐药性质，NCI N87/R细胞培养过程需加入一定量的曲妥珠单抗，终浓度为40 μg/mL。

2.2.2 重组质粒pGEX4T2-catTFRE的提取 catTFRE序列根据高等脊椎动物转录因子库设计（http：//jaspar.genereg.net/），将其链接到pGEX4T2载体上，得到全长为2.8 kb的重组质粒。将1 μL pGEX4T2-catTFRE质粒加入到50 μL TOP10感受态细胞中，经热激、复苏后涂布于氨苄抗性Luria-Bertani平板，37℃培养过夜，取单菌落接种于2 mL Luria-Bertani培养液，培养6 h，按1∶100接種至50 mL培养基， 培养18 h，按试剂盒说明提取质粒。

2.2.3 Biotin标记catTFRE DNA扩增 引物序列见2.1节，PCR反应体系及条件详见文献[8]。DNA序列见电子版文后支持信息。

2.2.4 Biotin标记catTFRE DNA的纯化与回收 catTFRE DNA经琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，使用DNA凝胶试剂盒回收、纯化，测定浓度后分装，20℃保存，备用。

2.2.5 核蛋白提取[10] 收集对数期生长的细胞，用预冷PBS清洗2次，重悬，800 r/min离心5 min，弃上清液。利用NE-PER试剂盒提取核蛋白，加入CERI和蛋白酶抑制剂，振荡，冰上裂解15 min。加入适量CERII，振荡10 s，冰上裂解30 s，4℃、16000 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀加入NER重悬，振荡20 s，4℃垂直混匀仪孵育1 h。4℃、16000 r/min离心20 min，将核蛋白提取物转移于EP管中，用Bradford法测定蛋白浓度。

2.2.6 catTFRE pull down[10] 取DynabeadsTM M-280 Streptavidin适量于EP管中，加入300 μL1×DNA结合缓冲液清洗M-280，加入计算量的catTFRE DNA（120 μL M-280结合3 pmol/L catTFRE DNA），再加入等量2×DNA结合缓冲液，4℃垂直混匀仪孵育20 min。用200 μL BC-200清洗M-280，加入核蛋白，用BC-0调整盐浓度至200 mmol/L，4℃孵育2 h，分别用50 mmol/L NETN和PBS清洗M-280。

2.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳 样品中加入20 μL上样缓冲液，混匀，95℃金属浴煮5 min，取上清液，进行SDS-PAGE电泳[10]，待Marker进入分离胶约2.0 cm停止电泳，用考马斯亮蓝染色。将胶条自下而上横切成6等份，分别置于EP管中，加入500 μL Destain脱色液，振荡至完全脱色，加入200 μL 75%乙腈，振荡30 min，吸去脱色液; 加入质谱水500 μL，振荡水化1 h，加入50 mmol/L NH4HCO3 300 μL，振荡5 min，吸去上清液，加入100 ng/μL胰酶-50 mmol/L NH4HCO3（1∶10，V/V）溶液，捣碎胶条，37℃孵育过夜，肽段消化后用200 μL乙腈萃取2次，合并萃取液，12000 r/min离心5 min，加入30 μL 0.1%甲酸，振荡5 min，再加入200 μL乙腈，振荡5 min，合并上清液，60℃真空抽干，质谱检测。

2.3 色谱及质谱条件

2.3.1 色谱条件 反相C18分离柱（2 cm×100 μm×3 μm，美国Thermo Fisher公司）; 反相C18分析柱（15 cm×75 μm×3 μm， 尖端开口5～10 μm， 美国Thermo Fisher公司）; 液相色谱分离条件为： 流动相A为0.1%（V/V）甲酸， 流动相B为0.1%甲酸-80%（V/V）乙腈， 梯度洗脱： 0～14 min， 8%～12% B; 14～51 min， 12%～27% B; 51～68 min， 27%～40% B; 68～69 min， 40%～100% B; 69～75 min， 100% B; 流速为350 nL/min。

2.3.2 质谱条件 纳升级电喷雾离子源（Nanoelectrospray ionization）， 离子源电压为2.0 kV， 母离子、子离子使用静态轨道阱（Orbitrap）检测; 一级扫描质荷比（m/z）为300～1500， 分辨率为70000， 扫描模式为Top-speed， 一级扫描的自动增益控制（Automatic gain control， AGC）为3000000， 最大注入时间为60 ms; 二级扫描范围自动设置， 分辨率为15000。离子隔离窗口为3 Th， 采用37%的能量进行高能碰撞解离（High-energy collisional dissocation， HCD）， 二级扫描的AGC为50000， 最大离子注入时间（Maximum ion injection time）为80 ms， 离子扫描电荷数为+2～+6， 排除同位素干扰峰， 动态排除时间为18 s。

2.4 质谱鉴定及数据分析

样品用0.1%甲酸复溶， 12000 r/min离心10 min，取上清液，用Easy-nLC 1000 nano液相色谱-Q Exactive Plus质谱进行检测，使用搭载Mascot 2.3搜索引擎的Proteome Discover 2.1（美国Thermo Fisher公司）进行搜库，数据库为人类生物技术信息中心蛋白质库（更新至04/07/2013，包含蛋白质数目为32015个）。母离子的质量公差（Mass tolerances）为20 ppm，子离子为0.5 Da; 允许胰酶漏切位点数≤2; 肽段长度为7～25个氨基酸; 蛋白质动态修饰为phosphor（Y）、phosohor（ST）、de Streak（C）、acetyl（protein N-term）、oxidation（M）。采用Percolator进行正反库搜索，控制肽段水平的假阳性率（FDR）<1%。

基于数据依赖性模式（Data dependent acquisition， DDA）采集数据。采用iBAQ方法对鉴定的蛋白质进行定量[14]，其基本原理为每个蛋白质鉴定到的全部肽段曲线下的面积之和（AUCs）与此蛋白的理论酶切肽段数（N）之比为此蛋白的表达量（AUCs/N）。用FOT（Fraction of total）代表蛋白质标准化后的峰面积[15]，即每个蛋白质的iBAQ除以样本中所有蛋白质的iBAQ （FOT=iBAQ/∑iBAQ）。为了计算方便，将鉴定到的所有蛋白质的FOT乘以105得到iFOT5。肽段筛选标准为： 每个蛋白质被检测的特异肽段数≥1，且Mascot ions scores≥20。数据分析采用两样本独立t检验，若某转录因子与DNA结合活性在亲代和耐药细胞中的比值大于1.5倍，且满足P<0.05，则认为该转录因子与DNA的结合能力增强，或转录因子表达量增加引起與DNA的结合能力增强，反之亦然。

2.5 Western blot检测相关蛋白质的表达

参照文献[15]提取NCI N87和NCI N87/R细胞核蛋白，进行western blot实验，抗体c-Jun、c-Myc、JunB和GAPDH稀释倍数为1∶1000，二抗稀释倍数为1：3000。目标蛋白经曝光后扫描图像，采用Image J进行灰度值检测并分析。

3 结果与讨论

3.1 pGEX4T2-catTFRE重组质粒的提取与纯化

参照文献[10]进行重组质粒pGEX4T2-catTFRE DNA提取与纯化。结果显示，在2.8 kb位置可见清晰且无干扰的目的条带（图1），与DL2000 DNA marker相比，提取质粒浓度≥100 ng/μL，浓度及纯度均符合实验要求。

3.2 catTFRE pull down实验

为检测和定量分析曲妥珠单抗耐药胃癌细胞转录因子，分别提取NCI N87和NCI N87/R细胞核蛋白，利用液相色谱-质谱结合catTFRE pull down的蛋白质组学技术对转录因子进行检测和定量分析，采用生物信息学技术分析与DNA的结合活性显著变化的转录因子（图2）。

3.3 质谱数据质控分析

对NCI N87和NCI N87/R样本分别进行3次生物学重复实验，基于Spearman方法进行相关性分析。每组中各个样本的相关系数r>0.85（图3），表明实验重复性良好。

3.4 激活转录因子的筛选与分析

从肽段水平设置1% FDR，共鉴定得到转录因子359个。为明确数据分布，对NCI N87/R和NCI N87样本的所有蛋白质的变化倍数（Fold change）进行总体分析，以NCI N87/R与NCI N87 3次生物学重复样本中蛋白质峰面积均值之比作为变化倍数，再进行对数转化，发现90%以上的蛋白质在NCI N87/R/NCI N87中的变化倍数介于1.5倍范围内，不足10%的蛋白质丰度变化较大（这些蛋白质具有较小的iFOT （iFOT<1）），总体数据符合正态分布（图4A）。因此，两组样本的均值满足独立样本t检验分析。根据显著性水平及均值的变化倍数绘制饼图，若某转录因子在3次重复实验的均值在两组样本中的比值大于1.5，即转录因子与DNA结合活性或其表达量变化≥1.5倍（Fold change≥1.5）且p<0.05， 则认为该转录因子在耐药细胞中被激活，其中Fold change（NCI N87/R/NCI N87）≥1.5且p<0.05表示转录因子与DNA的结合活性增强或表达量增加; Fold change（NCI N87/R/NCI N87）≤0.67且p<0.05表示与DNA的结合活性减弱或表达量降低。结果表明，61个转录因子与DNA结合活性在耐药细胞中发生了显著改变（电子版文后支持信息表S1），其中活性增强48个，活性减弱13个，活性未显著改变298个（图4B）。为更加直观显示转录因子的表达水平及其关系，依据生物学功能进行双边聚类分析，结果以热图形式可视化展示（图4C）。聚类关系为层次聚类，测量方法为欧式距离法，聚类算法为均值，方块颜色代表转录因子的表达水平，红色代表转录因子的表达量增加或与DNA的结合能力增强，绿色代表转录因子的表达量降低或与DNA的结合能力减弱（图4C）。

3.5 Western blot分析部分激活转录因子的表达水平

基于Western blot检测了c-Jun、c-Myc、JunB在NCI N87和NCI N87/R细胞中的表达水平，以进一步探究NCI N87/R细胞中转录因子激活的可能原因。检测结果表明，尽管c-Jun、c-Myc和JunB在NCI N87/R中的表达量有变化，但与NCI N87细胞相比，其表达差异无统计学意义（p值分别为0.11、0.50和0.43），提示耐药细胞转录因子激活可能由DNA结合活性的改变引起（图5）。

3.6 激活转录因子调控信号通路分析

利用STRING （https：//string-db.org/）数据库对相互作用得分>0.7（高可信度）的转录因子进行网络构建，进一步基于WebGestalt数据库（http：//www.webgestalt.org）中KEGG模块进行通路富集分析，利用Cytoscape（v.3.6.0）软件对富集结果进行可视化展示。筛选出显著性水平p<1×103的信号通路有10条，分别是癌症（p=1.33×106）、MAPK（p=4.16×105）、Wnt（p=7.34 ×105）、TGF-β（p=2.60 ×105）、凋亡（p=1.26 ×104）、DNA损伤（p =1.53 ×103）、PDGF（p=2.85×103）、白介素信号（p =4.72 ×103）、氧化应激反应（p=6.62 ×103）及Toll受体信号通路（p=7.48×103） （电子版文后支持信息图S1）。可以明显看出，在富集的所有通路中，癌症、MAPK、Wnt、TGF-β及凋亡信号通路具有较小的p值（定量结果见图6）。

MAPK、Wnt信号在肿瘤转化、耐药过程中相互影响，二者共同作用于GSK-3β，通过上调snail水平，降低E-cadherin表达，诱导肿瘤细胞EMT发生[16]。前期研究中[11，12]，已经证实MAPK、Wnt信号激活贡献胃癌曲妥珠单抗耐药，但对激活信号通路的促动因子尚未阐明。本研究发现，TCF7L2、TCF7、JUN、MYC、FOXC1、FOS、DDIT3、ELK4、NFκB2、AFT2在激活MAPK、Wnt通路中发挥重要的调控作用; 此外，本研究还发现了调控TGF-β、凋亡通路的转录因子，这些结果为进一步阐明胃癌曲妥珠单抗耐药机制奠定了基础。

3.7 激活转录因子家族分类

对转录因子进行分类研究是了解其生物功能的重要途径。本研究中鉴定得到的转录因子覆盖了DBD数据库（www.transcriptionfactor.org）中注释的80%以上的转录因子家族，包括bZIP、bHLH、homeobox、HMG box、Hormone受体、GATA、Zine finger、ETS等（电子版文后支持信息图S2）。这些转录因子具有信号转导调控、转录调控、细胞周期调控、代谢、发育、癌症发生与转移等多种生物学功能[7，17～19]。其中，ATF家族、TEF、NFIL3、JUN、JUNB、XBP1、DDIT3、FOSL1和FOS属于bZIP家族，CUX1、PBX3、DLX3、HOXA4、HOXA3、MEIS1、PBX1和BARX1包含homebox结构域，而FOXP1、ZNF740、ZNF282、KLF4和OVOL2归属于锌指蛋白家族。TCF7、TCF7L2、FOXC1、JUN及MYC在肿瘤EMT诱导耐药过程中发挥着重要作用[15，20，21]。

3.8 激活转录因子网络分析

为进一步明确激活转录因子之间的互作关系，进而了解与曲妥珠单抗耐药相关的转录因子，对激活转录因子之间的调控关系进行了分析。结果发现，整个网络以JUN和FOS为节点中心构成网络“骨架”，其它转录因子分别以此为中心构成下游网络邻居，其中JUN在整个网络中起正向调控作用，FOS起负向调控作用（图7A），以及由转录因子TCF7、TCF7L2、FOXC1、JUN和MYC组成的子网络（图7B），它们在肿瘤EMT过程中发挥重要调控作用。如TCF7L2与TCF7作为TCF/LEF家族成员，形成二聚体参与调控HMG box结合以及EMT、癌症的转移[22]，而且TCF7、TCF7L2和FOXC1也是Wnt通路的主要效应分子[23～25]; 由FOS、JUN、MYC和ATF2等构成的子网络在MAPK通路中发挥重要调控作用（图7C）[26～28]。

3.9 激活转录因子-靶基因分析

基于CellNet转录因子-靶基因数据库（http：//cellnet.hms.harvard.edu）构建了转录因子-靶基因调控网络[29]。将激活转录因子与蛋白质表达谱中的差异性表达蛋白质对接绘制网络图（图8）（全蛋白质表达谱数据见文献[11]），整個网络包括3个EMT-TFs调控模块，每个模块以TCF7L2、TCF7和FOXC1为效应分子进行网络构建，主要发挥对靶基因的正向调控作用; 此外，以CASP8为中心构成了负向调控网络， CASP8被转录因子TCF7L2、TCF7和FOXC1共同抑制，发挥负向调控作用。总体上，在耐药细胞NCI N87/R中，TCF7L2、TCF7和FOXC1对EMT相关靶基因起正向调控作用，而对凋亡信号起负向调控作用。CASP8是细胞重要的凋亡分子，直接参与凋亡启动和凋亡信号的活化过程，以及肿瘤的分化、转移等[30]。TCF7L2、TCF7和FOXC1负向调控CASP8的表达，导致耐药细胞抗凋亡能力进一步增强。综上，转录因子-DNA结合活性变化与蛋白质表达谱的结果相吻合，即胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药与EMT、Wnt、凋亡等多条信号通路的激活有关，提示针对这些转录因子所调控的信号通路可能是逆转耐药的有效途径。

4 结 论

本研究基于液相色谱-高分辨质谱结合catTFRE pull down蛋白质组学技术，检测并定量分析了NCI N87和NCI N87/R细胞的转录因子，从转录调控角度分析了转录因子驱动NCI N87细胞对曲妥珠单抗耐药的可能机制，并通过生物信息学手段分析了激活转录因子调控的信号通路，构建了其调控关系，探究了转录因子-靶基因的调控作用，阐释了EMT、Wnt、MAPK、凋亡等通路激活贡献胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药性，分析了调控EMT、Wnt和MAPK通路的多个靶基因。本研究为胃癌曲妥珠单抗耐药机制研究提供了依据，也为逆转其耐药治疗提供了参考。

References

1 Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I， Siegel R L， Torre L A， Jemal A. CA Cancer J. Clin.， 2018， 68（6）： 394-424

2 An E， Ock C Y， Kim T Y， Lee K H， Han S W， Im S A， Kim T Y， Liao W L， Cecchi F， Blackler A， Thyparambil S， Kim W H， Burrows J， Hembrough T， Catenacci D V T， Oh D Y， Bang Y J. Ann. Oncol.，  2017，  28（1）： 110-115

3 Zhang S Y， Huang W C， Li P， Guo H， Poh S B， Brady S W， Xiong Y， Tseng L M， Li S H， Ding Z X， Sahin A A， Esteva F J， Hortobagyi G N， Yu D H. Nat. Med.，  2011， 17（4）： 461-469

4 Aebersold R， Mann M. Nature，  2003，  422（6928）： 198-207

5 YAO Bao-Jin， ZHANG Mei， LIU Mei-Chen， WANG Qun， LIU Yu-Xin， ZHAO Yu. Chinese J. Anal. Chem.， 2018， 46（7）： 1152-1159

幺宝金， 张 梅， 刘美辰， 王 群， 刘宇昕， 赵 雨. 分析化学， 2018， 46（7）： 1152-1159

6 ZHOU Yuan， SHAN Yi-Chu， ZHANG Li-Hua， ZHANG Yu-Kui. Chinese Journal of Chromatography， 2013， 31（6）： 496-502

周 愿， 单亦初， 张丽华， 张玉奎. 色谱， 2013， 31（6）： 496-502

7 Lambert S A， Jolma A， Campitelli L F， Das P K， Yin Y， Albu M， Chen X， Taipale J， Hughes T R， Weirauch M T. Cell，  2018， 172（4）： 650-665

8 Zhang B， Wang J， Wang X J， Zhu J， Liu Q， Shi Z， Chambers M C， Zimmerman L J， Shaddox K F， Kim S， Davies S R， Wang S， Wang P， Kinsinger C R， Rivers R C， Rodriguez H， Townsend R R， Ellis M J C， Carr S A， Tabb D L， Coffey R J， Slebos R J C， Liebler D C. Nature，  2014，  513（7518）： 382-387

9 Marty F， Rockel-Bauer C， Simigdala N， Brunner E， Basler K. Methods，  2014，  68（1）： 260-264

10 Ding C， Chan D W， Liu W L， Liu M W， Li D， Song L， Li C H， Jin J P， Malovannaya A， Jung SY， Zhen B， Wang Y， Qin J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，  2013， 110（17）： 6771-6776

11 Liu W H， Chang J X， Liu M W， Yuan J B， Zhang J Q， Qin J， Xia X F， Wang Y. Oncotarget，  2017，  8（28）： 45793-45806

12 Liu W H， Yuan J B， Liu Z Z， Zhang J W， Chang J X. Int. J. Mol. Sci.，  2018，  19（7）： 1981

13 LIU Wen-Hu， YUAN Jiang-Bei， YANG Lan， CHANG Jin-Xia. Acta Pharm. Sin.，  2018，  53（11）： 1817-1824

劉文虎， 袁江北， 杨 兰， 常晋霞. 药学学报，  2018，  53（11）： 1817-1824

14 Schwanhusser B， Busse D， Li N， Dittmar G， Schuchhardt J， Wolf J， Chen W， Selbach M. Nature，  2011，  473（7347）： 337-342

15 Lai M， Liang L Z， Chen J W， Qiu N Q， Ge S， Ji S H， Shi T L， Zhen B， Liu M W， Ding C， Wang Y， Qin J. Mol. Cell. Proteomics，  2016，  15（7）： 2263-2278

16 Gu Y， Wang Q， Guo K， Qin W Z， Liao W T， Wang S， Ding Y Q， Lin J. J. Pathol.，  2016，  239（1）： 60-71

17 Kappelmann M， Bosserhoff A， Kuphal S. Eur. J. Cell Biol.，  2014，  93（1-2）： 76-81

18 Wang X， Simpson E R， Brown K A. Cancer Res.，  2015，  75（23）： 5001-5007

19 Candi E， Smirnov A， Panatta E， Lena A M， Novelli F， Mancini M， Viticchiè G， Piro M C， Di Daniele N， Annicchiarico-Petruzzelli M， Melino G. Biochem. Biophys. Res. Commun.，  2017，  482（3）： 440-444

20 Nakano N， Itoh S， Watanabe Y， Maeyama K， Itoh F， Kato M. J. Biol. Chem.，  2010，  285（49）： 38023-38033

21 Zhu X M， Wei L， Bai Y Q， Wu S， Han S Y. Am. J. Cancer Res.，   2017，  7（8）： 1642-1653

22 Li T Y， Zhu J， Wang X， Chen G W， Sun L， Zuo S， Zhang J L， Chen S W， Ma J， Yao Z H， Zheng Y W， Chen Z Y， Liu Y C， Wang P Y. Oncol. Lett.，  2017，  14（6）： 7384-7390

23 Han B C， Zhou B， Qu Y， Gao B W， Xu Y L， Chung S， Tanaka H， Yang W， Giuliano A E， Cui X J. Oncogene，  2018，  37（10）： 1399-1408

24 Hammond E， Lang J， Maeda Y， Pleasure D， Angus-Hill M， Xu J， Horiuchi M， Deng W， Guo F. J. Neurosci.，  2015，  35（12）： 5007-5022

25 Cevallos R R， Rodríguez-Martínez G， Gazarian K. Stem Cells，  2018，  36（5）： 683-695

26 Yokoyama K， Hiyama A， Arai F， Nukaga T， Sakai D， Mochida J. PLoS One，  2013，  8（9）： e73210

27 Gramling M W， Eischen C M. Cell Death Differ.，  2012，  19（7）： 1220-1227

28 Chen K C， Chiou Y L， Chang L S. J. Cell Biochem.，  2009，  108（3）： 612-620

29 Cahan P， Li H， Morris S A， Lummertz da Rocha E， Daley G Q， Collins J J. Cell，  2014，  158（4）： 903-915

30 Strter J， Herter I， Merkel G， Hinz U， Weitz J， Mller P. Int. J. Cancer，  2010，  127（4）： 873-880