高效液相色谱法测定木姜叶柯中根皮苷、三叶苷和根皮素的含量

王 钰，王 磊，张东星，李赫宇，晏仁义

(天津益倍生物科技集团有限公司 天津300457)

木姜叶柯(LithocarpusploystachyusRehd)，别名多穗柯、湖南甜茶、野金柴等，是我国传统民间草药和保健饮料植物，以叶入药，对高血压及冠心病有疗效[1]。据《中华中药志》记载：多穗柯茶能防治高血压，治疗湿热痢疾、皮肤瘙痒、痈疽恶疮等症，并具有滋养肝肾、和胃降逆、润肺止咳、解困醒酒等作用。

2017年 6月，木姜叶柯被批准为我国的新食品原料，化学成分主要是黄酮类物质，其中根皮苷常被作为木姜叶柯质量评价的成分指标。杨大坚等[2]从木姜叶柯的乙醇提取物中分离得到除根皮苷外，还有含量较高的成分三叶苷。文献报道木姜叶柯三叶苷对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有明显抑制作用，且具有较强的抗氧化能力，是一种有应用潜力的抗糖尿病活性物质[3]。因此三叶苷也是木姜叶柯的有效成分之一，经测定木姜叶柯中三叶苷的含量比根皮苷高出很多。本文为了更好地评价木姜叶柯药材质量，以 11批木姜叶柯样品为研究对象，以三叶苷、根皮苷和根皮素3个成分的含量作为评价指标。

1 检测仪器与样品

岛津 LC-2030C 3D高效液相色谱系统，包括洗脱泵、自动进样器、柱温箱和 PDA检测器(日本岛津公司)，KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，MS105DU型1/10万电子天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司)，TDZ4-WS台式低速离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)。

根皮苷、根皮素(纯度大于 98%)对照品购自中国食品药品检定研究院。三叶苷(纯度大于 98%)对照品为成都曼思特生物科技有限公司与中国科学院成都生物研究所联合制得。乙腈、甲酸均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。共从产地采集木姜叶柯叶样品11份。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱 Inertail ODS-3 C18(250mm×4.6mm，5µm)；流动相乙腈(A)-0.04%甲酸(B)梯度洗脱(表 1)；流速 0.8mL/min；柱温 40℃；检测波长285nm。在上述色谱条件下，样品中三叶苷、根皮苷和根皮素的色谱峰能达到较好的分离，且纯度检查符合要求，样品其他成分的测定无干扰，如图1。

图1 对照品和木姜叶柯样品的高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatography of references and sample

表1 流动相梯度洗脱数据(%)Tab.1 Gradient elution of mobile phase(%)

2.2 对照品溶液制备

精密称取真空至恒质量的根皮苷、三叶苷、根皮素5.00mg置于10mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，摇匀，用0.22µm微孔滤膜过滤，取滤液供测试。

2.3 供试品溶液制备

将多穗柯叶干燥、粉碎、研磨，过4号筛备用。精确称取多穗柯样品 0.25g，置于 25mL容量瓶中，加入适量 70%乙醇，超声处理(100W，40kHz)30min，取出、放冷、定容、摇匀、离心，取上清液 1mL定容于 10mL 70%乙醇中，摇匀，用 0.22µm 微孔滤膜过滤，取滤液供测试。

2.4 线性关系考察

精确称取根皮苷、三叶苷、根皮素对照品各5mg，置于 10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得标准品母液。精密吸取标准品母液按照 1、2.5、5、10、20、40、50 倍数进行稀释，得系列质量浓度溶液，取各个浓度的对照品溶液各 5µL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积。以进样量X(µg)为横坐标，峰面积值 Y为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数。同法逐级稀释，分别以信噪比S/N＝3和S/N＝10的进样浓度确定检测限和定量限，结果见表2。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品混合溶液 5µL，按上述色谱条件连续进样 6次，测定峰面积值。记录峰面积，计算峰面积的 RSD。结果显示根皮苷、三叶苷、根皮素峰面积的RSD分别为0.30%、0.37%、0.29%，表明仪器精密度良好。

表2 标准品的线性关系和范围Tab.2 Linear relationship and range of references

2.6 稳定性试验

取供试品溶液，分别于配制后 0、2、4、8、12、24h进样，记录根皮苷、三叶苷和根皮素的峰面积值，计算峰面积 RSD。结果显示，根皮苷、三叶苷和根皮素峰面积的RSD分别为0.94%、0.56%、1.49%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一份样品约 250mg，共 6份，按照2.3项下方法制备供试品溶液并进样、测定峰面积、计算含量。结果 6份样品中，根皮苷、三叶苷和根皮素的RSD分别为1.86%、1.1%和1.05%，表明此方法的重复性良好。

2.8 加样回收试验

精密称取已知含量的样品0.125g，共6份，分别加入一定量对照品，按 2.1项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表3。

2.9 样品的含量测定

取各药材粉末，按2.3项下的方法操作制备供试品溶液，每个样品平行 2份，并按 2.1项下的色谱条件进行测定，计算各供试品中 3种成分的含量，结果见表4。

表3 根皮苷、三叶苷和根皮素的加样回收率Tab.3 Results on recovery rate of phlorizin，trilobatin and phloretin

表4 根皮苷、三叶苷和根皮素的含量(%)Tab.4 Contents of phlorizin，trilobatin and phloretin in samples(%)

3 讨论和结论

本研究建立了通过 HPLC测定木姜叶柯中三叶苷、根皮苷和根皮素3种成分含量的方法，能将3种成分很好分离，经过方法学验证，证实该方法简便、准确、重复性好。克服了一些文献报道方法的缺点，比如张毅等[3]用高效液相法检测从多穗柯中分离纯化出的三叶苷，色谱条件 C18(150mm×4.6mm，5µm)，洗脱条件甲醇∶水＝60∶40，检测结果发现：三叶苷色谱峰的保留时间与根皮苷一致，经核磁共振波谱分析后证实三叶苷与根皮苷互为同分异构体。陈文等[4]用高效液相法测试木姜叶柯水提物中根皮苷的含量，色谱条件 C18(150mm×4.6mm，5µm)，洗脱条件甲醇∶水＝47∶53，检测结果根皮苷含量高达 92.8%，推测根皮苷与三叶苷的色谱峰未能分离。蒋珍藕等[5]研究紫外分光光度计测定木姜叶柯总黄酮的方法，发现芦丁是黄酮醇类的化合物，而木姜叶柯中的总黄酮成分是二氢查尔酮，两者在结构上存在较大的差异，所以用经典方法以芦丁为对照品，通过络合比色法测定木姜叶柯总黄酮的结果并不理想。之后，采用以根皮苷为对照品，采用直接紫外测定法测定总黄酮，结果比较可靠。

采用本文建立的方法对 11批样品进行了测定。本实验中，以 4～8月份的木姜叶柯为材料，测定三叶苷、根皮苷和根皮素的含量，结果发现，根皮苷从4～8月份含量大幅度增加(0.74%～6.26%)。三叶苷从4～6月份的含量大幅度降低(17.14%～0.66%)，之后含量变化不明显(0.20%～0.67%)。根皮素4月份到6月份的含量小幅度降低(0.42%～0.22%)，7月份和8月份样本检测不到根皮素。整体而言，木姜叶柯中根皮苷、三叶苷和根皮素含量变化具有一定规律性：随着月份增加根皮苷含量增加，三叶苷含量降低，根皮素含量逐渐降低至没有。说明木姜叶柯在整个生长周期中，有效成分会发生转变，其发生机理有待于进一步深入研究，为提高木姜叶柯有效活性成分的含量提供有力的依据。