四指马鲅、多鳞四指马鲅种间差异的DNA条形码分析及SCAR标记开发

杨翌聪，李活，刘锦上，郑佩明,庞德彬，蒙子宁，林浩然

(1.中山大学生命科学学院∥有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东 广州510275；2.茂名市金阳热带海珍养殖有限公司，广东 茂名525400)

四指马鲅(Eleutheronematetradactylum)隶属鲻形目(Mugiliformes)、马鲅科(Polynemoidae)、四指马鲅属(Eleutheronema)[1]，俗名马友，其肉质细嫩、营养丰富，是海水鱼类中的名贵品种，具有较高的食用价值和经济价值[2]。目前，四指马鲅的人工繁育和养殖技术在我国尚处于起步阶段，商品鱼主要依靠人工捕捞。然而由于过度捕捞和环境污染，四指马鲅的渔获量日益减少，难以满足人们对该名贵海水鱼类的需求[3-5]。

我国海域分布的马鲅科鱼类共有3属7种，很多种类的外部形态特征极为相似，在形态学分类上容易混淆, 常被误认为同种鱼类[5]。尤其是四指马鲅属的四指马鲅和多鳞四指马鲅(Eleutheronemarhadinum)，不但生活环境相似，在黄海、东海、南海等海域均有分布，而且成鱼除胸鳍颜色、侧线鳞数目和犁骨齿板不同外，其他形态学特征几乎相同，难以从外形上区分[5]。二者的鱼卵、仔稚幼鱼常混栖于同一海域，且不具有成鱼的形态学特征，进一步增加了研究它们早期生活史的困难。

DNA分子标记反映的是物种内在的遗传差异，不受外部形态及发育时段的影响，已成为鉴定海洋鱼类相似种的有力工具。DNA barcoding(DNA条形码)和SCAR(sequence characterized amplified regions，序列特定扩增区域标记)是两种常用于种类鉴定的DNA分子标记。前者主要利用种间线粒体COI(细胞色素C氧化酶亚基I)基因序列差异来进行物种鉴定[6]。后者是在RAPD(random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态DNA)分子标记技术的基础上，将RAPD标记转化为稳定的SCAR标记。该标记克服了RAPD重复性差的缺陷，已广泛应用于生物的亲缘关系、遗传多样性和种质鉴定等研究[7-8]。

我国关于四指马鲅的研究大多集中在养殖和捕捞方面[4, 9]，涉及种质资源和遗传分子标记的研究不多[10-11]。为此，本研究首先利用基于线粒体COI基因序列的DNA条形码技术对四指马鲅和多鳞四指马鲅进行种间遗传差异分析，从DNA变异水平上对两种鱼类进行鉴别；然后采用RAPD技术对这两种马鲅进行遗传多样性分析，将获得的种特异性RAPD标记转化为SCAR标记后，无需测序，仅通过一次PCR和电泳即可完成鉴定。有了准确且方便快捷的种类鉴定技术，就可进一步研究马鲅的系统分类、生态分布、生活史及遗传育种等，为马鲅鱼类的遗传背景研究和种质资源保护提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

实验样品四指马鲅取自茂名市金阳热带海珍养殖有限公司，多鳞四指马鲅取自中国水产科学研究院东海水产研究所。每种各取4个尾，剪取鳍条与肌肉保存于无水乙醇。形态学鉴定根据胸鳍颜色、侧线鳞数目和犁骨齿板等形态学特征[5]。

1.2 DNA提取

DNA提取方法参照天根海洋动物组织DNA提取试剂盒(TIANamp marine animals DNA kit)说明，DNA提取后放置在-80 ℃下保存备用。

1.3 DNA条形码技术分析

所用引物序列参照Ward(2005)[12]，F1:5′TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC3′；F2:5′TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC3′；R1: 5′TAGA CTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA3′；R2: 5′ACTTCAG GGTGACCGAAGAATCAGAA3′。反应总体积为20 μL,其中ddH2O 6 μL，模板(约20 ng/L)2 μL，PCR反应混合液Starmix(GeneStar公司)10 μL，引物F1与F2等体积混合液(10 μmol/L)1 μL，引物R1与R2等体积混合液(10 μmol/L)1 μL。反应程序为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共进行30个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物用w=1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶分析仪(Tanon 1600R)观察并拍照。将特异性强且产量高的PCR产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行双向测序，测序引物同PCR。

采用Chromas软件阅读测序峰值，DNAman 7.0软件进行序列拼接和人工校对。将校对过的序列在NCBI网站上进行BLAST，验证所得PCR片段是否为目标序列。将文件转换为fasta格式后，用CLUSTAL X 1.8软件进行序列比对，输出文件形式CLUSTAL格式，用MEGA 4.1软件转换为MEGA格式并统计碱基组成,计算两种鱼类基于Kimura 2-parameter模型的种间遗传距离，构建Neighbor-joining系统树。利用DNAsp5软件统计变异位点(variablesites,V)、核苷酸多样性(nucleotide diversity,Pi)。用DNAman 7.0软件进行同源性分析，输出序列比对结果图片。

1.4 SCAR标记开发

以稀释10倍的四指马鲅和多鳞四指马鲅DNA为模板，选用10条上海生工公司随机引物进行扩增(表1)。反应总体积为18 μL，其中ddH2O 6 μL，模板(约20 ng/L)1 μL，PCR反应混合液Starmix(GeneStar公司)10 μL，随机引物(5 μmol/L) 1 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，36 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共进行40个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用w=1.8%琼脂糖凝胶电泳检测(100 V，1.5 h)。凝胶分析仪(Tanon 1600R)观察并拍照。

利用TIANgel Midi Purification Kit胶回收试剂盒(天根公司)从琼脂糖凝胶中回收种间特异性条带，连接到克隆载体pMD-18T Vector(TAKARA公司)，并转化到大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。根据特异性条带的序列结果用Primer premier 5.0引物设计软件设计合成大小为16～20 bp的SCAR引物，先根据参考退火温度进行预实验，筛选出特异性良好的引物进行PCR反应条件优化，调整退火温度并延伸引物长度。

2 结 果

2.1 基于DNA条形码两种马鲅种间的遗传差异

在四指马鲅和多鳞四指马鲅4个个体中均能扩增出约600 bp的片段，经序列拼接后得到655 bp的COI基因部分序列。四指马鲅4个样本的COI基因序列相同，碱基含量(T，C，A，G)分别为28.5%，28.7%，24%，18.8%，A+T(52.5%)含量高于C+G(47.5%)。多鳞四指马鲅除在第20位碱基个体r1(T)与其他3个个体(C)不同外，其余654bp碱基组成均相同，碱基组成与四指马鲅类似(表2)，A+T(51.4%)含量也高于C+G(含量48.6%)，与脊椎动物线粒体轻链组成一致[13]。

序列差异比较显示，四指马鲅与多鳞四指马鲅的COI基因核苷酸序列同源性为93.34%。在655 bp的COI基因序列中，共有87个变异位点(见图1)，核苷酸多样性(Pi)为0.132 82。利用MEGA 4.1计算的两种鱼类基于Kimura 2-parameter的种间遗传距离为0.151(表2)。

从GeneBank数据库获取马鲅科多指马鲅属(Polydactylus)的五指多指马鲅(Polydactylusplebeius，KJ202190)、六指马鲅(Polydactylussextarius，KP266788)和小口马鲅(Polydactylusmicrostomus，KJ468474)COI基因序列；用与马鲅亲缘关系较近，同属于鲻形目的鲻科鱼类Mugilcurema(DQ441607)同源序列作为外群，应用MEGA 4.1中的Neighbor-joining程序进行聚类分析(图2)。

表2 四指马鲅(T)和多磷四指马鲅(R)COI基因的碱基组成及遗传信息指数

图1 四指马鲅(t1～t4)和多鳞四指马鲅(r1～r4)的COI基因部分序列比对Fig.1 Sequence alignment of the COI gene of E. tetradactylum (t1～t4) and E. rhadinum(r1～r4)

图2 基于COI基因数据的5种马鲅科鱼类NJ分子系统树(鲻科鱼类M.curema为外群)Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on COI gene sequences of five Polynemid species (M. curema as outgroup)

2.2 四指马鲅种特异性的SCAR标记开发

10条随机引物可获得四指马鲅与多鳞四指马鲅明显不同的RAPD电泳图谱，进一步说明两个群体之间存在差异。其中，在引物为S4的RAPD电泳图谱中发现了种特异性条带，即大小约为1 300 bp条带只出现四指马鲅中，为四指马鲅所特有(如图3)。对四指马鲅约1 300 bp的种特异性的RAPD条带进行切胶回收，克隆测序。

根据序列结果设计引物，经多次筛选和PCR条件优化，最终得到效果理想的两对引物SCAR1和SCAR5(表3)。优化后的PCR扩增体系为：反应总体积为20 μL,其中ddH2O 6 μL，模板(约20 ng/L)2 μL，PCR反应混合液Starmix(GeneStar)10 μL，正向引物(10 μmol/L)1 μL， 反向引物(10 μmol/L) 1 μL。反应程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s， 45～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共计32个循环；最后72 ℃延伸10 min。

从图4可以看出，SCAR1和SCAR5均在四指马鲅中扩增出单一的特异性条带，而在多鳞四指马鲅中未出现此扩增带(图4)。

图3 引物S4对四指马鲅(t1～t4)和多鳞四指马鲅(r1～r4)的RAPD图谱(箭头所指的为四指马鲅特异性条带)Fig.3 RAPD patterns of E. tetradactylum (t1～t4) and E. rhadinum (r1～r4) produced by primer S4. (The arrow refers to the species-specific band of E. tetradactylum)

表3 SCAR标记的引物序列、退火温度及扩增片段大小Table 3 Primer sequence annealing temperature and the size of PCR band of SCAR marker

图4 引物SCAR1和SCAR5对四指马鲅(t1～t4)和多鳞四指马鲅(r1～r4)基因组DNA的扩增结果Fig.4 Electrophoretogram of the E. tetradactylum (t1～t4) and E. rhadinum (r1～r4) amplified by primers SCAR1 and SCAR5

3 讨 论

3.1 四指马鲅和多鳞四指马鲅的种间差异及亲缘关系

DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用线粒体COI基因在种内保守，种间序列差异较大的特性来进行物种鉴定的，常用作海洋动物种以上水平的检测。本研究只从多鳞四指马鲅种内检测到1个核苷酸变异、四指马鲅4个个体序列完全相同，但两物种间却存在变异位点87个，体现了此基因的保守性和变异性。Hebert等[14]对动物界的11个门13 320个物种进行分析，发现物种内的遗传距离很少>0.02，大部分的种内遗传距离<0.01[14]。柳淑芳等[15]对石首鱼科的30种鱼类进行COI基因序列分析，得出红牙(Otolithesruber)印度洋和南海两个地理群体间的遗传距离超过0.02，遗传分化已达到种的水平。彭居俐等[16]基于COI基因序列比对，发现4种鲌属鱼类的种间平均遗传距离都大于0.02。本研究中，四指马鲅和多鳞四指马鲅基于Kimura 2-parameter模型计算的种间遗传距离为0.151，大于物种种间的最小遗传距离0.02，因此我们认为它们属于两个不同种的鱼类。

根据构建的NJ系统树(图2)，同属于四指马鲅属的四指马鲅和多鳞四指马鲅先聚为一支，信度高达97%，说明它们具有较近的亲缘关系。值得注意的是，五指多指马鲅先与四指马鲅属聚类，而不是和同为多指马鲅属的六指马鲅和小口马鲅聚类，与形态学分类不一致。马鲅科许多种类鉴别特征不显著，传统形态学分类存在分歧，而且其分类地位及系统进化方面的研究很少，仅见Motomura等[17-19]根据鳍骨等形态学特征对多指马鲅属部分物种命名错误进行更正，Wang G.等[20]基于线粒体基因序列发现四指马鲅先与六指多指马鲅聚为一支，再与鲻形目的其他种聚类。因此，五指多指马鲅与四指马鲅属亲缘关系是否比多指马鲅属其它鱼类更为接近还有待于进一步的研究探讨。

3.2 SCAR标记的建立与应用

基于RAPD标记获得的特异性标记理论上已可以应用于物种鉴定,但由于RAPD对PCR扩增条件的敏感性，在实际应用中难以获得稳定结果，不能保证分子标记的可重复性[21]。因此，需将RAPD标记转化为SCAR标记以解决RAPD标记稳定性差的问题，构建一种简便快速稳定的分子标记和物种鉴定方法。本研究根据RAPD特异性条带中间序列共设计了5对引物，其中有2对成功转化为SCAR标记(SCAR1和SCAR5),其它3对引物未能获得单一目的片段。类似的现象在奥利亚罗非鱼(Oreochromiscoaureus)[22]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[23]的SCAR转化中均存在，可能是因为引物序列在该物种基因组中有多处可以与之结合并扩增出片段，使其不具有特异性。

目前，SCAR标记已被广泛应用于植物的种质鉴定和抗病育种上[24-27]，在水产种质鉴别中也有相关的研究报道[28]。曾珍等[8]对松江鲈鱼(Trachidermusfasciatus)4个群体进行RAPD分析，将其中2个RAPD标记转化为SCAR标记作为鉴别松江鲈鱼滦河与其他3个群体的分子标记。高风英等[21]对3个奥利亚罗非鱼品系进行遗传分析，成功转化2个SCAR标记作为奥利亚罗非鱼群体的遗传标记。丁炜东等[29]成功转化一个SCAR标记作为草鱼(Ctenopharyngodonidellus)家养群体的分子遗传特征指标，与草鱼野生群体进行区分。本研究获得的2个SCAR标记(SCAR1和SCAR5)，分别扩增出四指马鲅469 bp和606 bp种特异性条带，可以作为区分四指马鲅及其近缘物种多鳞四指马鲅的遗传分子标记，应用于种质鉴定和遗传资源保护实践中。