免疫因子与间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征相关性研究

杨安卿，夏 宇

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院，上海 200025;2.上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海 200025)

间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征是一种病因尚未明确、以膀胱慢性疼痛为主要症状的严重膀胱炎症综合征［1］，对患者身心健康及生存质量的不良影响不亚于慢性癌症疼痛、肾脏透析［2］.目前，包括膀胱切除在内的间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征临床治疗方案均难以获得满意的效果［3］.相关研究［4］显示:自身免疫、膀胱黏膜屏障受损、炎症反应、神经异常兴奋等均与间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征发病有关，其中肥大细胞活化引发的膀胱免疫反应是研究热点之一.本研究收集了42例间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征患者的膀胱黏膜组织，透射电子显微镜观察肥大细胞脱颗粒情况，免疫组化法检测白细胞介素IL-2，IL-10，Siglec-15的表达水平，探讨免疫因子在间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征发生、发展中的作用.

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月—2018年10月上海交通大学医学院附属瑞金医院收治的间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征患者42例为观察组，均符合加拿大泌尿外科协会(CUA)颁布的间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征诊治指南中的标准.其中，男6例，女36例;年龄 49～75 岁，平均(55.38±2.52)岁;病程 10～25 个月，平均(15.95±3.63)个月.收集同期行输尿管镜检查的18例患者正常膀胱组织为对照组，其中，男3 例，女15 例;年龄51～73 岁，平均(54.95±2.17)岁.两组受试者性别、年龄之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，所有观察组患者盆腔疼痛和尿频、尿急症状(PUF)评分在18～30分，平均(25.10±2.85)分.本研究经医院伦理委员会审核批准，受试者均签署知情同意书.

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集与制备

间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征患者行膀胱镜随机活检及硬膜外麻醉下水扩张，观察扩张前后膀胱黏膜情况并取活检组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm切片.对照组在行输尿管镜检查时随机取膀胱黏膜组织，制备方法同观察组.

1.2.2 透射电子显微镜观察

预冷的生理盐水洗涤标本后，用手术刀分割为边长为1 mm的组织块，放入2.5%的戊二醛溶液，4℃下固定过夜;次日用磷酸缓冲液洗涤3次，1%锇酸固定，丙酮梯度脱水，包埋后光镜切片，柠檬酸铅与醋酸双氧铀双染色，透射电子显微镜下观察并拍照.

1.2.3 免疫组化染色

取膀胱黏膜组织切片，梯度乙醇脱水，3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，热抗原修复.3%正常山羊血清封闭，滴加鼠抗人IL-2单克隆抗体(1∶200稀释)、鼠抗人IL-10单克隆抗体(1∶500稀释)、兔抗人Siglec-15单克隆抗体(1∶500稀释)，4℃孵育过夜;次日滴加HRP标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG，均为1∶1 000稀释，室温下反应2 h，DAB显色，苏木素复染，脱水透明后封片.磷酸缓冲液代替一抗为空白对照.结果判定:光学显微镜下每张切片随机取5个视野，每个视野计数200个细胞.细胞中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性，根据染色强度分为无染色(阴性)、黄色(弱阳性)、棕黄色(强阳性).

1.3 统计学分析

应用SPSS 18.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(珋x±s)表示，计数用百分率表示，行方差分析、t检验、χ2检验，以 P＜0.05 为差异具有统计学意义.

2 结 果

2.1 透射电子显微镜下浆细胞和肥大细胞的表达

观察组42例间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征患者中36例(85.71%)在透射电子显微镜下观察可见浆细胞和肥大细胞，其中肥大细胞出现脱颗粒状态26例(72.22%).见图1.对照组膀胱黏膜组织中透射电子显微镜下未见浆细胞和肥大细胞.

图1 透射电子显微镜下观察组患者膀胱黏膜组织中浆细胞和肥大细胞Fig.1 Plasma cells and mast cells in bladder mucosa of patients in observation group by transmission electron microscopy

2.2 两组膀胱黏膜组织中 IL-2，IL-10，Siglec-15的表达情况

观察组患者膀胱黏膜组织中IL-2，IL-10呈弱阳性、强阳性表达的比例明显高于对照组，IL-2，IL-10呈阴性表达的比例明显低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01);膀胱黏膜组织中Siglec-15表达情况在两组间差异无统计学意义(P＞0.05).见表1.观察组患者膀胱黏膜组织中 IL-2，IL-10，Siglec-15阳性表达情况见图2.

表1 两组膀胱黏膜组织中IL-2，IL-10，Siglec-15的表达情况Tab.1 Expression of IL-2，IL-10 and Siglec-15 in bladder mucosa between two groups n(η/%)

图2 IL-2，IL-10，Siglec-15在观察组患者膀胱黏膜组织中阳性表达Fig.2 Positive expression of IL-2，IL-10 and Siglec-15 in bladder mucosa of patients in observation group(SP×400)

2.3 观察组膀胱黏膜组织中IL-2，IL-10，Siglec-15表达与PUF评分的关系

观察组IL-2强阳性患者的PUF评分明显高于弱阳性和阴性患者，差异具有统计学意义(P＜0.01);IL-10强阳性患者的PUF评分明显高于弱阳性和阴性患者，差异具有统计学意义(P＜0.01);Siglec-15阴性患者的PUF评分明显低于阳性和强阳性患者，差异具有统计学意义(P＜0.01).见表 2.

表2 观察组膀胱黏膜组织中IL-2，IL-10，Siglec-15表达与PUF评分的关系Tab.2 Relationship among the expression of IL-2，IL-10，Siglec-15 and PUF score in bladder mucosa of observation group

表2 观察组膀胱黏膜组织中IL-2，IL-10，Siglec-15表达与PUF评分的关系Tab.2 Relationship among the expression of IL-2，IL-10，Siglec-15 and PUF score in bladder mucosa of observation group

注:与阴性表达比较，a:P＜0.05

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3 讨 论

间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征的发病机制目前仍未明确，相关研究［5］显示:间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征与其他自身免疫性疾病具有部分相同的特点，并以膀胱黏膜组织中肥大细胞增殖活性为突破口进行探究.本研究在透射电子显微镜下可观察到间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征患者膀胱黏膜组织中存在浆细胞和肥大细胞，且其中72.22%的患者出现肥大细胞脱颗粒现象.浆细胞主要通过分泌IgE抗体激活肥大细胞发挥生物学活性.有研究［6］发现:间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征患者膀胱层均被浆细胞浸润，抑制膀胱黏膜组织中肥大细胞脱颗粒是目前间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征治疗的热点之一［7］.

研究［8］发现:T细胞分泌的IL-2，IL-10等细胞因子可诱发B细胞增殖并产生IgG，IgE等抗体，与肥大细胞受体特异性结合后活化肥大细胞，分泌并释放组胺、前列腺素、白三烯、趋化因子、一氧化氮等炎症因子，导致炎症反复发作.组织学研究［9］显示:间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征患者膀胱壁组织中存在嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞浸润，IL-10等介导免疫反应的Th2类细胞可活化嗜酸性粒细胞、巨噬细胞，分泌并释放白三烯、组胺等炎症因子，增加毛细血管通透性和平滑肌收缩性，IL-10表达水平与间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征患者临床症状明显相关.IL-2在人体多种正常上皮组织中均存在表达，参与体内免疫应答过程［10］.IL-2在淋巴细胞、肥大细胞、血管内皮细胞中表达上调，在间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征中与干细胞因子具有协同作用，可促进肥大细胞增［11］.本研究显示:观察组膀胱黏膜组织中IL-2，IL-10阳性表达率明显高于对照组，且观察组IL-2，IL-10强阳性患者的PUF评分明显高于弱阳性和阴性患者，提示肥大细胞相关炎症因子在间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征发生、发展中发挥重要作用，且与病情严重程度具有一致性.

活化和抑制作用平衡在维持人体免疫系统正常生理功能方面具有重要作用，免疫细胞中抑制因子表达下调会引发自身免疫性疾病，磷酸化信号通路介导肥大细胞活化，抑制该通路相关受体可下调肥大细胞活性［12］.Siglec家族是肥大细胞表达的抑制性受体，多表达于免疫细胞上的跨膜黏附蛋白，具有抑制免疫细胞信号调节的作用［13］.肥大细胞可选择性表达Siglec-15，并与唾液酸配体结合后发挥负调节作用，抑制肥大细胞脱颗粒.本研究显示:间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征患者中Siglec-15阳性表达者的PUF评分明显低于阴性者，提示Siglec-15阳性表达可缓解间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征患者的临床症状;但Siglec-15表达在观察组与对照组之间无明显差异，可能与间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征属于免疫性疾病有关.相关研究［14］显示:使用单克隆抗体激活Siglec-15后可抑制IgE受体活化，进而抑制肥大细胞脱颗粒.因此，Siglec-15作为肥大细胞表面的选择性靶点有望成为间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征治疗的新途径.