伏马毒素B1对猪肾上皮细胞增殖的影响

袁巧玲，范 颖，宁玲忠，苏建明，雷红宇

（湖南农业大学，长沙 410128）

伏马毒素B1（FB1）属于一种烟曲霉毒素，是串珠镰刀菌产生的次级代谢产物[1]。其主要污染玉米、大豆、小麦等粮食作物及其制品[2]。FB1已经被证明在所有伏马毒素中毒性最强。该毒素热稳定性较好，成为危害畜禽健康的一个重要原因[3]。伏马毒素可引起人类食管癌和神经管型缺陷病、马与兔的脑组织损伤、灵长类动物动脉粥样硬化、猪肺水肿等[4]。随着国内外毒理学研究工作者的不断探索，该毒素对人类、植物以及动物的毒性作用与机制逐渐地被挖掘。但是目前还没有详尽的证据支撑其是否对体外培养的猪肾上皮细胞具有增殖抑制效应。因此，本文以猪肾上皮细胞为体外研究模型，探究PK15细胞染毒FB1后对其细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

FB1购于Sigma公司；猪肾上皮细胞PK15由湖南农业大学动物医学院馈赠。

1.2 MTT检测细胞增殖

取PK15细胞悬液，接种于96孔板，预培养过夜。将培养基更换为含有FB10、10、20、40 μg·mL-1的新鲜培养基。培养24和48 h时，弃去培养基，依次加入100 μL·孔-1的新鲜培养基（含MTT溶液10 μL），避光培养4 h后弃上清，加二甲基亚砜150 μL，混匀。10 min后，于酶标仪490 nm处检测各孔吸光度，计算细胞相对活力。

1.3 qPCR检测周期相关基因的mRNA表达水平

PK15细胞在染毒处理48 h后，根据TRIZOL试剂盒（全氏金生物科技有限公司）说明书，提取细胞总RNA。测定RNA浓度，反转录得cDNA。将cD⁃NA稀释，加入荧光定量qPCR的其他反应试剂。将反应体系放入荧光定量PCR仪进行扩增并分析数据。以GAPDH为内参基因，采用2－ΔΔCT法计算目的基因的相对水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计分析

试验数据采用SPSS 21.0进行处理，两组间比较为t检验，多组间的比较应采用单因素方差分析，结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 FB1对PK15细胞活力的影响

MTT检测细胞活力的结果见图1。

由图1可知，FB1作用于PK15细胞24 h后，细胞活力未出现下降变化，但是当FB1作用时间增加到 48 h 时，40 μg·mL-1FB1组中细胞活力显著下降。表明FB1能降低PK15细胞活性，抑制细胞的增殖。

2.2 FB1对PK15细胞周期相关基因表达的影响

qPCR检测结果见图2。

图1 FB1对PK15细胞活性的影响

图2 FB1对PK15细胞周期相关基因表达水平的影响

由图2可知，与对照组相比，FB1处理组中细胞核增殖抗原PCNA（图2 C）与细胞周期蛋白Cyclin B（图2 A）和Cyclin D（图2 B）的mRNA表达水平显著下降，而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21（图2 D）和P27（图2 F）的mRNA表达水平显著增加。

3 讨 论

FB是一种常见的霉菌毒素，对畜牧业存在很大的威胁。有研究报道，FB能降低畜禽的生长性能[5]。但是由于毒物的获得问题，当前国内外对该毒素的动物体内毒性研究多集中在FB这一类化合物上的探索，而非单一的高纯度FB1。这也很难阐明其毒性的产生是否与FB1有直接关联，甚至很难确定FB1是否在发挥主导的毒性作用。另外，肾脏是动物的主要排泄器官，也是多种毒素主要攻击的对象。该脏器的严重损伤对动物的泌尿系统会产生不可忽视的危害。因此本研究探索了FB1对猪肾上皮细胞PK15增殖的影响，研究证实，高浓度的FB1处理PK15细胞48 h显著地抑制了该细胞的增殖。

细胞增殖是细胞的基本生物学特性，异常的细胞增殖或过度增殖都可能会影响细胞的生理功能。肾上皮细胞是构成肾脏的基本结构单元。肾上皮细胞的增殖受到抑制，与肾脏疾病有一定关联，影响肾脏的代谢和排泄功能。细胞周期蛋白调控细胞的增殖，一个完整的细胞周期需要由不同的细胞周期相关蛋白参与[6]。目前已发现的与细胞周期调控有关的分子主要包括3大类：细胞周期蛋白（Cyclin B、Cyclin D和Cyclin E等），细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK-2等），细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（P21、P27等）。其中CDKs是调控网络的核心，Cyclins对CDKs具有直接调控作用，P21与P27等对细胞增殖具有负性调控作用，共同构成细胞周期调控的分子基础[7]。PCNA是细胞增殖核抗原，在细胞增殖的启动上发挥重要作用[8]。本研究发现，FB1显著抑制了PCNA的mRNA表达，细胞周期蛋白Cyclin B和Cyclin D的mRNA表达显著下降，推测细胞增殖受到抑制可能与细胞在G1到S的进程中受到阻滞有关。同时也发现，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21和P27的表达显著增加。研究证实，伏马毒素对其他动物细胞存在抑制细胞增殖作用，即FB15~20 μg·mL-1可使人脐静脉血管内皮细胞的增殖阻滞在G0/G1期，导致细胞增殖受到抑制[9]。综上所述，FB1可通过调控周期调控相关基因的表达，抑制猪肾上皮细胞的增殖。