利用一株凝结芽孢杆菌发酵酸解玉米秸秆生产乳酸

倪志华，张玉明*

（河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002）

乳酸是一种重要的有机酸，以乳酸为单体合成的聚乳酸生物塑料被认为是石化塑料的最佳替代品之一，利用可再生生物质生产乳酸可实现资源绿色循环应用[1]。我国是农业大国，玉米秸秆资源丰富，利用玉米秸秆生物炼制乳酸，不但可以降低原料成本、实现农业废弃物绿色利用，而且可以解决秸秆丢弃、焚烧造成的环境污染问题[2-3]。

微生物是生物炼制的主要参与者，根霉菌和乳酸细菌是研究最多的乳酸生产菌。刘占英等[4]对一株可直接降解纤维素生产乳酸的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）进行紫外诱变育种，该菌株可利用玉米秸秆获得0.63 g/L乳酸。李鑫等[5]以米根霉（Rhizopus oryzae）为菌种，生物转化经汽爆和碱处理后玉米秸秆酶解液（含有葡萄糖100 g/L），最终获得69.15 g/L乳酸。对乳酸生物炼制过程优化可降低生产成本，提高乳酸生产效率。王刚等[6]使用左旋乳酸芽孢杆菌W-1开展了玉米秸秆同步糖化发酵（simultaneous saccharificationandfermentation，SSF）产乳酸研究，在90g/L葡萄糖基质中添加高温蒸煮的玉米秸秆和纤维素酶300U/L，经过6 d发酵可获得72 g/L乳酸。陈晓佩等[7]对米曲霉进行细胞固定化处理，将浓缩的玉米秸秆酸爆液（含有葡萄糖60 g/L）转化为乳酸36.4 g/L，糖酸转化率63.5%。

目前，利用秸秆生物炼制乳酸存在菌种适应性差、原料利用率低、糖酸转化率低等技术难题，尚未实现工业化生产[8]。针对上述问题，本研究以一株凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）为菌种，开展玉米秸秆生物炼制乳酸研究。借助该菌株高温发酵、己糖/戊糖高效利用等特点，以期建立一种利用酸解玉米秸秆发酵生产乳酸新工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米秸秆：采集于河北省保定市东金庄村农田；纤维素酶（25FPU/mL）：宁夏夏盛集团；β-葡萄糖苷酶（593CBU/mL）：丹麦诺维信公司；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纤维二糖（纯度均为99%），L-乳酸钠（纯度98%）：阿拉丁公司；其余化学试剂均为分析纯。

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）CGMCC No.7635（以下简称菌株BCO）：本实验室保存。发酵培养基：葡萄糖60 g/L，酵母粉20 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L，121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

BLBIO-7GC发酵罐：上海佰伦公司；LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司；MLS-3750全自动灭菌锅：日本三洋公司；SBA-40D生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所。1.3方法

1.3.1 菌株BCO混合糖发酵实验

由于玉米秸秆等木质纤维素水解液中可发酵糖类主要为葡萄糖、木糖和阿拉伯糖[2]，本实验首先考察菌株BCO利用混合糖发酵乳酸能力。分别向发酵培养基中添加总质量浓度为60 g/L的混合糖，其中A组为20 g/L葡萄糖+33 g/L木糖+7g/L阿拉伯糖，B组为30g/L葡萄糖+25g/L木糖+5g/L阿拉伯糖。乳酸发酵实验在发酵罐中进行，培养条件为50℃、100 r/min、pH 6.0。

1.3.2 玉米秸秆预处理和酶解实验

玉米秸秆洗净、烘干、粉碎，过80目筛，以1∶8（mg∶L）的固液比置于2%硫酸溶液中，混匀后121℃湿热处理90 min，5 000 r/min离心15 min获得的上清液定义为酸水解液；离心获得的沉淀使用水洗涤至中性，烘干至质量恒定，定义为水不溶物（water insoluble solid，WIS）。将WIS用50 mmol/L柠檬酸钠缓冲溶液（pH4.8）溶解，添加纤维素酶后在50℃、200r/min条件下进行酶解实验。为了避免酶解产物纤维二糖的抑制作用，酶解时加入20CBU/g纤维素的β-葡萄糖苷酶。

1.3.3 糖化发酵

将斜面培养的菌株BCO接种到含有20 g/L葡萄糖的发酵培养基中，45℃、100 r/min培养6 h，制备BCO种子培养液。将干质量为100g的玉米秸秆使用1.3.2方法进行预处理，将预处理后的料液pH值调整为5.0后加入终浓度2%的酵母粉和BCO种子培养液进行发酵实验（接种量为5%）。当料液中葡萄糖质量浓度＜1.0g/L时，加入纤维素酶开启SSF生产乳酸实验。当发酵体系中乳酸浓度不再增加时，加入WIS粉末40 g和纤维素酶进行补料实验以提高产物乳酸浓度。SSF在发酵罐中进行，培养条件为50℃、100 r/min、pH5.0。上述方法中纤维素酶添加量均为20 FPU/g纤维素。

1.3.4 测定方法

发酵液中糖和产物浓度：使用高效液相色谱仪测定[9]；玉米秸秆中纤维素含量：采用美国国家可再生能源实验室（nationnal renewable energy laboratory，NREL）推荐的方法测定[10]；L-乳酸含量：由生物传感分析仪测定；发酵产物中L-乳酸的光学纯度计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 菌株BCO对混合糖的利用

图1 不同碳源比例对菌株BCO发酵生产乳酸的影响Fig.1 Effect of different carbon source ratio on lactic acid productionby strain BCO

由图1可知，当使用A组碳源时，菌株BCO对葡萄糖和木糖的利用几乎是同步的，发酵开始16 h后，碳源耗尽；使用B组碳源时，菌株BCO首先利用葡萄糖，再利用木糖和阿拉伯糖，发酵过程持续到20 h时碳源耗尽。这种优先利用葡萄糖，再依次利用其他碳源的现象，称为碳源代谢阻遏（carbon catabolite repression，CCR）效应[11]。CCR效应会严重降低混合糖利用速度，导致发酵时间延长。因此，针对解除CCR效应的研究工作有很多报道，涉及菌种遗传改造[12]和发酵策略设计[13]。本研究显示，菌株BCO在利用混合糖时存在CCR效应，并且糖浓度比例变化也会影响菌株的糖利用模式。使用A组碳源和B组碳源所获得产物乳酸的终质量浓度分别为（50.54±1.42）g/L和（51.04±1.23）g/L，糖酸转化率分别为（0.92±0.02）g/g和（0.93±0.02）g/g。该结果说明，BCO能够同型发酵葡萄糖、木糖和阿拉伯糖生产乳酸，且具备高温发酵特点，非常适合SSF工艺。

2.2 利用玉米秸秆酸水解液发酵生产乳酸

通常木质纤维素经预处理后产生糠醛、乙酸等副产物会对微生物生长产生强烈的抑制作用，甚至会影响其对底物的转化效率[14]。

玉米秸秆经预处理，所得玉米秸秆稀酸水解液中含有混合糖（葡萄糖（6.95±0.98）g/L、木糖（23.39±1.23）g/L、阿拉伯糖（5.35±0.87）g/L）和一定量的发酵抑制物（乙酸（2.01±0.12）g/L，甲酸（0.04±0.01）g/L，糠醛（0.02±0.01）g/L，5-羟甲基糠醛（0.03±0.02）g/L）。由图2可知，由于料液中存在一定量的抑制物，接种开始8h后菌株BCO才开始利用其中的糖基质生产乳酸，发酵24h后获得乳酸（30.93±0.62）g/L，糖酸转化率为（0.93±0.02）g/g。表明菌株BCO对玉米秸秆酸水解液中混合糖实现了同型乳酸发酵，且预处理产生的副产物未对发酵过程产生明显影响。

图2 菌株BCO发酵玉米秸秆酸水解液生产乳酸Fig.2 Production of lactic acid from corn stalk acid hydrolysate by strain BCO

2.3 玉米秸秆WIS的纤维素酶解

使用100g玉米秸秆酸解后获得WIS的干质量为（58.72±2.16）g，以其为底物考察纤维素酶添加量对酶解效率的影响（固液填充比率为5.87%），酶解结果见表1。

表1 纤维素酶添加量对酶解效率的影响Table 1 Effect of cellulase addition on enzymatic hydrolysis efficiency

由表1可知，随着纤维素酶添加量的增加，酶解时间不断缩短，并且酶解产物葡萄糖的质量浓度也逐渐升高。纤维素酶添加量达到20 FPU/g时，酶解时间缩短至30 h，酶解产物葡萄糖的质量浓度增至22.26 g/L；继续增加纤维素酶添加量，酶解时间及酶解产物变化不大。因此综合酶解效率和纤维素酶成本考虑，20 FPU/g纤维素酶+20 CBU/g β-葡萄糖苷酶是玉米秸秆WIS的最佳酶用量，此时玉米秸秆WIS的酶解效率为（63.54±2.03）%。该结果也说明2%硫酸预处理方法可以使玉米秸秆中纤维素充分暴露，被纤维素酶水解。

2.4 菌株BCO利用酸水解玉米秸秆SSF发酵生产乳酸

菌株BCO具备纤维二糖的利用能力[9]，因此SSF过程无需额外添加β-葡萄糖苷酶，菌株BCO利用酸水解玉米秸秆SSF发酵生产乳酸过程曲线见图3。

图3 菌株BCO利用玉米秸秆固态发酵生产乳酸过程曲线Fig.3 Curve of lactic acid production from corn stalk by strain BCO with solid-state fermentation

由图3可知，由于酶解作用，发酵体系中葡萄糖和纤维二糖浓度迅速增高。但是随着菌株BCO的生长，葡萄糖和纤维二糖逐渐被转化为乳酸，酶解产物抑制被有效缓解。葡萄糖和纤维二糖是纤维素酶解的两个最重要抑制物，菌株BCO可将上述两种碳源发酵生成乳酸，不仅提高了SSF效率，并且可降低纤维素酶使用量[15-16]。在发酵开始65 h后，料液中基质几乎消耗完全，乳酸含量为（38.38±1.03）g/L。此时100 g玉米秸秆生物转化得到乳酸（40.19±1.22）g，L-乳酸光学纯度为（99.23±0.22）%。与其他中温菌SSF发酵过程相比，BCO生长温度与商品纤维素酶最佳活力温度相一致，纤维素酶的活性得到全部发挥，因此发酵过程更为高效[8]。乳酸生物炼制时，受限于原料预处理填充率问题，不能获得高浓度的糖，因此产物乳酸浓度偏低[17]。针对此问题，有研究使用汽爆[18]等高效的原料预处理方法或者改进纤维素酶解工艺，可获得到高浓度的可发酵糖类[19]。当然，进行SSF发酵时采用补料工艺也可获得浓度产物[20-21]。本研究在SSF发酵进行至65 h时和100 h时，分别补加了玉米秸秆WIS干粉40g和纤维素酶（补加量为20FPU/g纤维素）。由于补加了底物和酶，BCO进行了“二次发酵”，玉米秸秆WIS酶解产物（葡萄糖和纤维二糖）被持续利用。发酵至135h后，产物乳酸含量达到（82.56±1.28）g/L。借助菌株BCO和工艺优化，本研究建立的玉米秸秆生物炼制乳酸方法，可将原料酸解/酶解获得的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖高效转化生成乳酸，省去了料液脱毒和WIS与玉米秸秆酸解液分别发酵的多步工艺单元。

3 结论

凝结芽孢杆菌BCO具有高温生长，同型发酵葡萄糖、木糖和阿拉伯糖生产乳酸能力，是一株良好的乳酸生物炼制菌。本研究使用的2%硫酸预处理工艺可酸解100 g玉米秸秆生成葡萄糖（6.95±0.98）g/L、木糖（23.39±1.23）g/L、阿拉伯糖（5.35±0.87）g/L。以其为发酵培养基碳源，菌株BCO可发酵获得乳酸（30.93±0.62）g/L，糖酸转化率（0.93±0.02）g/g。进一步开展玉米秸秆SSF研究，原料经酸水解后无需固液分离，调整pH值后以20 g/L酵母粉为氮源，添加纤维素酶20 FPU/g纤维素后发酵生产乳酸，65 h后可获得乳酸（38.38±1.03）g/L，其中L-乳酸光学纯度为（99.23±0.22）%。为了提高产物浓度，向发酵体系补加玉米秸秆WIS和纤维素酶，最终获得乳酸（82.56±1.28）g/L。