猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)--10年回眸

韩玉莹，李永锋，谢利豹，仇华吉

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069)

1 猪瘟及C株疫苗概况

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是猪的一种以高热稽留和广泛性出血为主要特征的高度传染性疾病，给许多国家的养猪业造成了重大的经济损失[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列入须申报(Notifiable)的动物疫病名录。在国务院印发的《国家中长期动物疫病防治规划(2012～2020年)》中，将猪瘟列为5种优先防治的“一类动物疫病”之一。

猪瘟病毒(CSFV)是CSF的病原，它是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员。CSFV为单股正链RNA病毒，其基因组全长约12.3 kb，包含5'非编码区(Untranslated region，UTR)、一个长的开放阅读框(ORF)和3'UTR。该ORF编码由3 898个氨基酸组成的多聚蛋白，这一多聚蛋白在细胞和病毒蛋白酶的作用下裂解为12个成熟的病毒蛋白，包括4种结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)，其中Erns、E1和E2为病毒的囊膜蛋白[2-3]。

目前，我国主要采取免疫接种的措施来预防猪瘟，常用的疫苗为猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株或HCLV株)。C株是我国学者在20世纪50年代通过将CSFV强毒株在兔体内连续传480余代后培育而成的，该疫苗株集高度安全性和良好免疫原性于一身，可以同时诱导体液免疫和细胞免疫反应，对各种年龄的家猪和野猪均安全，并且能够保护不同年龄的猪抵抗猪瘟强毒的攻击[4]。由于C株性能稳定、安全性和免疫效果良好，在国际上被公认为安全有效的弱毒疫苗。早在20世纪60年代，C株从我国引入东欧和亚洲国家，被称为“K株”或“LC株”，随后又传到西欧和拉美各国，其为世界猪瘟的防控做出了重大贡献[5]。时至今日，C株仍被世界上许多国家使用，其地位和价值至今无可动摇。

凭借严格的防控计划和扑杀政策，北美及欧洲部分发达国家已经消灭了猪瘟[1]，我国也将猪瘟净化工作提上日程。早在2012年，农业部制订的《国家中长期动物疫病防治规则(2012～2020)》中，确定我国动物疫病防治的总体目标与任务，提出将猪瘟作为我国优先防治的一类动物疫病之一，对我国猪瘟的净化和防控提出了指导性意见和具体的净化策略。该规划明确指出：在2015年我国部分区域需达到猪瘟净化标准，原种猪场达到净化标准；2020年进一步扩大净化区域，全国所有种猪场达到净化标准。2017年，根据《国家中长期动物疫病防治规划(2012～2020年)》要求，农业部组织制定了《国家猪瘟防治指导意见(2017～2020年)》，要求“在不断提高养殖场(户)防疫能力的基础上，到2020年底，全国所有种猪场和部分区域达到猪瘟净化标准，并进一步扩大猪瘟净化区域范围”的目标。

就当前形势来看，我国猪瘟净化的工作势在必行，配合净化猪瘟的技术支持也应该到位。众所周知，C株在猪瘟防控过程中发挥着重要作用，但是由于其不具备标记功能，不能区分疫苗接种和野毒感染(DIVA)，这使得C株在猪瘟净化工作中面临巨大的挑战。现阶段，如何赋予C株疫苗DIVA特性是众多科学家努力的方向。我国科学家在此方面进行了大胆的探索，开展了一系列的研究工作，旨在将C株改造为标记疫苗株，以达到DIVA的目的。本研究团队曾全面回顾了C株问世后50余年的研究进展[4]，本文将在其基础上对C株最近10余年的最新研究进展进行综述。

2 对C株的再认识

2.1 C株的来源 C株是由我国老一辈科学家将CSFV强毒株在兔体内连续传数百余代获得的[4]，其独特的研制历程堪称为疫苗史上的一座丰碑。但由于其年代久远，其原始病毒株已无从考证。10多年前，有学者认为，1945年在中国分离的石门(Shimen)强毒株是C株的亲本病毒[6]，但后来Xia等通过对Shimen株和C株的全基因组测序显示，C株与Shimen株的亲缘关系并不近。因此没有足够的证据证实之前的说法[7]。随后，科学家们为了探究猪瘟兔化弱毒疫苗株之间的亲缘关系，对包括Rovac及C株在内的多个疫苗株进行了测序分析，结果显示，早期的猪瘟兔化疫苗株Rovac与C株之间并无亲缘关系[8]。时至今日，C株的来源仍然是个谜。

2.2 C株适应家兔的分子机制研究 病毒经过多次传代后可以获得对细胞或异种宿主的适应性。例如，经过多次传代后获得了细胞适应性的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus， HCV)，其滴度比亲本病毒约高1 000倍[9]。病毒的囊膜蛋白在病毒对细胞或异种宿主的适应性中起重要作用。例如，HCV囊膜蛋白中3个位点的突变使其获得了对小鼠肝细胞的适应性[10]。许多弱毒疫苗株是将病毒在细胞或异种宿主中经多次传代培育而成的，如C株、山羊化兔化牛瘟弱毒疫苗和马传染性贫血弱毒疫苗等。这些疫苗为我国猪瘟的防控及牛瘟和马传贫的净化做出了巨大贡献。然而，迄今为止关于这些弱毒疫苗株适应细胞或异种宿主的确切机制尚不明确。

C株特有的创制过程赋予了其在家兔中独特的生物学特性。与CSFV Shimen强毒株相比，C株可以在家兔脾脏和淋巴结组织中复制引起家兔的定型热反应。研究CSFV适应家兔的机制，有利于揭示CSFV跨越种间障碍在非易感动物中增殖的机制，也能够为建立动物模型提供新思路。本研究团队前期构建了一系列C株和Shimen株UTR互换的嵌合病毒，并利用家兔评价了这些嵌合病毒的生物学特性。研究显示，病毒基因组的UTR是C株引起家兔定型热反应所必需的，而病毒编码区决定了C株对家兔的适应性[11]。最近，本研究团队将CSFV Shimen株与C株的Erns、E1和E2蛋白基因互换构建了一系列嵌合病毒以及包含E2蛋白不同氨基酸突变的突变体病毒并在家兔体内对其进行了评价。该研究显示，以Shimen强毒株为骨架，包含C株Erns-E1-E2、Erns-E2和E1-E2的嵌合病毒可以在家兔脾脏中复制，表明C株E2蛋白与Erns或E1赋予C株对家兔的适应性；E2蛋白结构域I中第108P和第109T是C株适应家兔所必需的[12]。尽管目前C株适应家兔的分子基础得到了较明确的解析，然而其适应家兔的分子机制尚未取得实质性的进展，还需要本团队深入的探究。

2.3 C株致弱机制的研究 CSFV从无毒力株到能够引起100%死亡率的高毒力株均有[13]，其中C株是将CSFV强毒株在家兔体内连续传代最终获得的弱毒疫苗株。但对于C株的致弱机制，即CSFV强毒株是如何在家兔体内致弱的并不清楚。不过，最近取得的一些研究成果对C株致弱机制提供了新的视野。

已有研究显示，C株3'UTR中存在12 nt的插入序列，而在其它CSFV强毒株中不存在该序列。为了研究12 nt的插入对病毒的复制以及毒力的影响，研究者以强毒Shimen株为骨架，在3'UTR中引入12 nt的插入或者用C株3'UTR替换Shimen株3'UTR构建了两株嵌合病毒。研究显示，在PK-15细胞中两株嵌合病毒的最大滴度比亲本病毒Shimen株下降约100倍。体内感染试验显示，这两种嵌合病毒表现出与C株类似的特性，可以诱导猪产生中和抗体并完全保护猪免受强毒的攻击。这些数据表明，C株3'UTR中12 nt的插入足以减弱CSFV的毒力，这在一定程度上揭示了C株致弱的分子基础[14]。最新的研究数据显示，CSFV结构蛋白E2氨基酸序列中T745I和M979K的突变与病毒的致病性密切相关。利用反向遗传操作平台，研究者拯救了突变病毒vSM/CE2/T745I、vSMCE2/M979K和vSM/CE2/T745I-M979K。动物试验表明，T745I和M979K这两个点突变提高了病毒的复制水平，而且这2个残基在vSM/CE2的体外复制和体内致病性发挥了关键作用[15]。

综上所述，科学家们在病毒的层面部分解析了C株的致弱机制。本研究团队前期研究显示，相比CSFV强毒株，C株E2蛋白第37D的突变使其失去了拮抗宿主蛋白Trx2介导的抗病毒反应的能力，这可能是C株致弱的一个重要机制[16]；最近还发现，强毒Shimen株和C株接种猪后，其干扰素、肿瘤坏死因子和白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6和IL-10等的应答存在明显差异[17]。这些数据从全新的角度阐明了C株可能的致弱机制。

2.4 C株对部分猪瘟病毒株不能提供完全保护 中国兽医药品监察所对我国猪瘟分子流行病学研究的数据显示，我国流行的CSFV分属为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个基因型，1.1、2.1、2.2、2.3和3.4 5个基因亚型。我国大陆的E2基因序列大部分属于Ⅱ型，其中2.1亚型占到了一半以上[18]。2.1基因亚型病毒株具有遗传多样性，涂长春研究员团队的研究分析显示，2.1亚型又进一步分为10个亚亚型(2.1a-2.1j)。除了2.1d仅流行于印度外，其它9个亚亚型在中国及其周边国家流行，甚至流行于欧洲的部分国家[5]。

2011年，在我国广西地区出现了CSFV 2.1a亚型[19]。3年后，我国学者首次在国内分离到CSFV 2.1d亚型[20]，同时，Luo等也对中国猪瘟的流行趋势进行了一定分析[21]。最近，我国许多接种C株的猪场出现了猪瘟疫情，经检测病原为CSFV 2.1d基因亚型。有关实验数据显示，接种C株并用CSFV 2.1d HLJZZ2014株攻毒的猪没有出现任何临床症状并且全部存活。但这些猪表现出轻微的病理学和组织学损伤，并且在各种组织和血液样品中检测到CSFV RNA[22]。总之，中国各企业生产的不同来源的C株疫苗之间存在分子变异和抗原差异，并且可以对机体提供针对中国出现的2.1d基因亚型CSFV攻击的临床保护但不能对其提供病理学和病毒学保护[22]。然而，研究人员对CSFV 2.1d亚型是否在我国流行以及C株能否对CSFV 2.1d亚型提供完全保护存在不同的结论，这需要进一步调查分析。

3 对C株的深度开发与利用

3.1 C株生产工艺的更新 C株疫苗的生产工艺在我国得到了不断的更新，具体可以分为3个阶段。第一阶段：动物组织苗，包括家兔脾淋组织苗、乳兔组织苗和牛体反应苗；第二阶段：动物原代细胞苗，包括原代乳猪肾细胞苗、绵羊肾细胞苗、奶山羊肾细胞苗和犊牛睾丸细胞苗；第三阶段：传代细胞苗，包括传代猪睾丸细胞(Swine testis cells，ST细胞)苗及传代牛睾丸细胞(Bovine testis cells，BT细胞)苗[23]。现阶段预防猪瘟的活疫苗主要有兔脾淋源、原代细胞源和猪瘟传代细胞源3种。这3种疫苗的制备工艺、优缺点及疫苗运输存储方法等详见表1[24]。

表1 市售3种猪瘟兔化弱毒疫苗产品的比较

近10年来，C株的生产工艺最为显著的进展是利用猪睾丸传代细胞系(ST细胞系)生产猪瘟疫苗，并且利用生物反应器代替传统的转瓶培养细胞。该疫苗生产工艺相比之前的工艺，其生产疫苗的稳定性高、批间差异小、质量可控、疫苗抗原含量显著增加。用ST细胞系生产的猪瘟疫苗免疫猪，抗体水平较传统的组织苗与原代细胞苗相比明显提高[23]。此外，科研人员还对生物反应器生产的猪瘟活疫苗进行了相关研究：郁宏伟等发现，将已感染CSFV的细胞直接接种至反应器培养，收获病毒液制备猪瘟活疫苗(传代细胞源)的生产工艺明显缩短了疫苗的生产周期。同时，ST细胞在生物反应器中可以实现高密度生长，并且可以带毒传代，病毒收获量大且稳定。更重要的是，生物反应器的自动化水平较高，生产过程稳定可控，保证了生产的猪瘟活疫苗质量稳定且产品批间差异小。值得注意的是，该生产工艺的病毒收获量与传统转瓶培养的病毒收获量相比有明显提高，一个周期病毒的收获量相当于600个转瓶的单次收获量，而且培养时间较转瓶培养时间缩短一半，生产效率显著提高，在降低生产成本方面有明显优势[25]。

疫苗耐热冻干保护剂在C株的应用很大程度上解决了疫苗在运输过程中由于保存不当导致的病毒失活问题。近年来，我国加大对耐热冻干保护剂的研究投入，技术水平迅速提高，部分已达到发达国家的水平。耐热冻干保护剂的使用可以将普通冻干疫苗的保存温度由-15℃提高到2℃～8℃，在有效保护疫苗的基础上，使其保存时间更久，保存期延长至18个月以上。刘业兵等研制了适用于猪瘟脾淋毒活疫苗的耐热保护剂，利用该保护剂生产的猪瘟疫苗，在经过耐老化试验(37℃保存10 d)和保存期测定(2℃～8℃保存12个月)后仍然符合疫苗产品质量标准的要求[26]。与此同时，大量的田间试验数据也表明，耐热保护剂并不影响猪瘟疫苗的免疫效果，加入耐热保护剂的猪瘟活疫苗与不加耐热保护剂的疫苗一样安全有效，而且疫苗在加入耐热保护剂之后显示出良好的热稳定性能，便于运输和使用[26]。研究者对疫苗保存期的测定以及保存后的免疫保护试验数据显示，在2℃～8℃条件下，将猪瘟脾淋毒耐热保护剂活疫苗保存24个月后免疫猪，仍然能够对CSFV Shimen强毒株的攻击提供完全保护[27]。目前，我国猪瘟活疫苗(细胞源)为猪瘟疫苗的主要产品，耐热保护剂在猪瘟疫苗中的应用明显降低C株疫苗在运输和保存过程中的降效或失效问题。

总之，随着我国C株疫苗生产工艺的进步和耐热冻干保护剂的应用，该疫苗的生产质量显著提高、生产成本明显降低、运输和保存更方便，保证了C株疫苗的质量，且避免了因疫苗质量问题导致的免疫失败，在一定程度上提高了我国防控猪瘟的能力。

3.2 基于C株的标记疫苗的研制 随着全球范围内猪瘟净化工作的不断开展，部分欧洲和美洲国家已经彻底消灭了猪瘟[1]，这对我国净化猪瘟具有重要的借鉴和指导意义。但是现阶段我国净化猪瘟还面临着诸多挑战，现有的包括C株在内的所有猪瘟弱毒疫苗均无法区分自然感染猪和疫苗接种猪，这种技术上的不足在很大程度上限制了我国猪瘟净化工作的开展。

标记疫苗是一种新型疫苗，该疫苗通过配套的血清学鉴别诊断方法，即可区分免疫抗体与野毒感染抗体。利用反向遗传学操作平台对野毒株或弱毒疫苗进行基因操作是创制标记疫苗的有效手段之一，通过基因水平的插入、缺失或突变原始病毒株的某一位点，可以对病毒进行标记或区分[28]。

迄今为止发现的与CSFV抗原相关的蛋白有3种，分别为结构蛋白Erns、E2和非结构蛋白NS3。CSFV的抗原表位主要分布于结构蛋白Erns和E2中，可以刺激机体产生中和抗体[29]。由于NS3含有的抗原表位在瘟病毒属中具有很高的保守性，很难鉴别区分，这使得结构蛋白Erns和E2成为构建候选标记疫苗株的基础。CSFV E2蛋白存在较多的抗原表位，其中WH303是E2蛋白中高度保守的抗原表位，识别的最小表位基序是TAVSPTTLR[30]，这为后续基于WH303位点的突变标记病毒株的构建提供了理论依据。最近有研究报道，以C株为骨架，突变WH303抗原表位(TAVSPTTLR)的1个氨基酸以及缺失该表位2个氨基酸构建的候选标记疫苗(C-DIVA)，能够区别疫苗免疫与野毒感染，该疫苗也是第一个基于C株的候选标记疫苗[31]。该候选疫苗的研制为后续构建以C株为骨架的标记疫苗提供了新的方法。廖迅等尝试了多种策略研制C株标记疫苗，包括构建了携带流行株E2的嵌合重组C株和携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns基因的重组C株，并利用相应的单克隆抗体(MAb)来区分疫苗接种猪与自然感染猪[32]。同时，理想的猪瘟标记疫苗应该具有以下特征：1、疫苗安全有效，质量可控；2、能够区分疫苗接种动物与自然感染动物；3、不散毒不排毒；4、对靶动物和非靶动物遗传稳定；5、常规条件下生产工艺简单；6、能够通过简便的方法进行鉴别诊断；7、产生免疫保护迅速且终生免疫；8、可以抵御不同猪瘟病毒株的攻击[33]。值得注意的是，利用血清学方法区分C株以及野毒株的研究并不多，目前仅Qiagen公司推出了可以鉴别C株免疫和野毒感染的商品化血清学诊断试剂盒。在未来，研制基于C株的标记疫苗及其配套的血清学鉴别诊断方法将会成为区分疫苗株以及野毒株的一种有益尝试，这对于猪瘟的净化和彻底根除也是十分必要的。

3.3 C株在创制多联疫苗中的潜在应用价值 从安全性和免疫原性角度来看，C株具有作为活病毒载体的巨大潜力和优势。最近本研究团队利用CSFV反向遗传操作技术，首次以C株为骨架构建了表达PCV2 Cap蛋白的重组C株。该研究证实，Cap基因在重组病毒中遗传稳定，且重组C株能够在家兔体内复制引起家兔的定型热反应，并且其免疫原性与C株保持一致，部分重组C株还可以诱导机体产生特异性抗Cap蛋白抗体[34-35]。这对利用C株作为病毒活载体构建安全有效的猪病多价疫苗的研制提供了新的思路和平台。目前我国已经在多地暴发非洲猪瘟疫情，而目前尚没有针对该病的有效疫苗，C株具有作为活载体构建非洲猪瘟疫苗的优势。另外，C株可以与其它疫苗制备多联疫苗，如猪瘟、猪丹毒、猪多杀性巴氏杆菌三联活疫苗、猪瘟-猪丹毒二联活疫苗、高致病性猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟二联活疫苗等。基于当前我国猪病疫情复杂，混合感染严重，新发传染病不断涌现，今后多联疫苗将是防控猪病的重要武器，相信基于C株为载体的多价疫苗以及与C株联合制备的多联疫苗在我国猪病的防控需求下会及时问世。

4 问题与展望

4.1 致弱机制和适应机制研究滞后 与研制的其它猪瘟弱毒疫苗相比，C株的优势尤为明显：能够提供完全的临床保护；不排毒、不散毒；在猪体内反复传代，均未发现C株毒力返强[4]。然而，该优秀疫苗株自身潜在的诸多科学问题尚未回答，例如它是如何致弱的、如何适应家兔并在其中复制的、其适应家兔与病毒的致弱是否相关等。目前，能够支持C株复制的兔源细胞的缺失是限制C株基础研究的主要瓶颈。通过免疫组化、报告基因活性检测以及荧光定量PCR等方法确定C株感染家兔脾脏的靶细胞，之后实现靶细胞的永生化将是构建支持C株复制的兔源细胞系的有效途径。

4.2 实验室拯救的C株病毒培养滴度较低 2007年，我国将猪瘟列入强制免疫计划，对所有猪均要免疫。在实施了近10年的强制免疫、重点监测后，我国猪瘟流行情况趋于稳定，2017年猪瘟退出了国家强制免疫计划[36]。C株广泛应用于CSFV的临床防控，但目前的C株疫苗并不具备标记的特性，无法满足市场的需求，也不能为国家提出的“净化猪瘟”号召提供技术上的支持。猪瘟标记疫苗株的研制和应用对于实现国家猪瘟净化这一长远目标提供了可行的路线，但是标记活疫苗的研发依赖于反向遗传操作平台，但利用反向遗传平台拯救的C株病毒滴度为104TCID50[37]，远低于商品化的C株疫苗。如果能够对平台加以改造，使拯救的病毒滴度提高，将有利于猪瘟标记疫苗的制备，显著降低生产成本。换言之，寻求安全有效的高产猪瘟弱毒疫苗株，对其进行标记，也可以作为构建猪瘟标记疫苗株的一种手段。

最近有研究者构建了来源于C株的重组病毒，并且在PK-15细胞中连续传代以获得高的子代病毒产量。结果显示，细胞适应型病毒变种RecCpp80的效价比其亲本C株提高近1 000倍，但丧失了诱导家兔发热的能力[38]。该研究为提高经反向遗传操作拯救的C株病毒滴度提供了一个很好的思路和方法。同时，本研究团队对近几年提高疫苗抗原产量的方法进行了总结，包括改造病毒基因、改善病毒对细胞的适应性、优化抗原表达体系和改进疫苗生产工艺等多个方面[39]，这对未来提高C株病毒的滴度具有一定的参考意义。