人参皂苷Rd Re对胎鼠体外神经干细胞促增殖分化作用的影响

张薇 谭渊 黄志健 王大明*

神经干细胞（NSCs）是具有自我更新、多潜能的细胞，能分化成神经系统主要细胞类型，如神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞［1］。研究表明人参皂苷Rb1能促进海马细胞新生，改善学习记忆能力［2］，人参皂苷Rg1能促进动物脑内蛋白质合成，显著提高大鼠海马突触传递活动［3］。在大鼠脑梗死后24h内给予人参皂苷Rd可促进SVZ区的NSCs增殖［4］。虽人参皂苷Re有抗短波紫外线（UVC）效果，能减少UVC辐射引起的细胞早期凋亡［5］，但目前关于Re对NSCs增殖和分化鲜少提及，关于其他人参皂苷对NSCs增殖比较也尚未提及。另外，虽有文献指出人参、银杏叶、丹参能通过介导PI3K/AKT信号通路发挥调控作用，但对该通路中上下游靶标的具体作用机制尚无研究［6］。本团队在观察人参皂苷Rb1、Rg1对NSCs体外促增殖和分化的作用比较后［7］，继续行人参皂苷中属于原人参二醇中另具代表性Rd和原人参三醇中Re对胎鼠皮质区原代NSCs体外促增殖和分化比较，并初步探索人参皂苷Re可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 所有动物实验均遵循澳门大学中药研究国家重点实验室及澳门大学中华医药研究院伦理委员会制定的准则，严格遵守动物实验伦理原则。本研究实验所用小鼠为C57BL/6 SPF级，由澳门大学中华医药研究院动物中心提供。

1.2 试剂、药物及实验仪器 （1）试剂和药品：人参皂苷Rd、Re单体（纯度≥98%）（曼思特，成都），DAPI（Santa Cruz，USA），A-M568，Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG（H+L）（Invitrogen，USA），A-M488，Alexa Fluor 488 goat antimouseIgG（H+L）（Invitrogen，USA），Anti-Mouse-GFAP（Sigma，USA），Anti-Mouse-Tuj1（Sigma，USA），Anti-Mouse-Nestin（Millipore，USA），5-BrdU（MCE，USA）Anti- Mouse- Brdu（Millipore，USA），DPBS（Dulbecco'sPhosphate Buffered Saline）（Gibco，USA），Laminin（Sigma，USA），Poly-llysine（PLL）（Sigma，USA），FBS（fetal bovine serum）（Gibco，USA），EGF（Recombinant HuMan EGF）（Peprotech，USA），bFGF（RecombinantHuMan FGF-basic）（Peprotech，USA），B-27 Supplement（50X）（Gibco，USA），N-2Supplement（100X）（Gibco，USA），DMEM/ F- 12（1 ∶ 1）basic（1X）（Gibco，USA）。（2）主要实验仪器：细胞培养箱（Thermo），生物安全柜（ThermoFisher），离心机（ZONKIA），解剖显微镜（Leica），荧光显微镜（ZEISS），细胞分析仪 2000（GeneralElectric Company）。

1.3 NSCs分离培养和传代方法 （1）NSCs分离培养：孕鼠（孕12～13d）颈椎脱臼法处死。显微镜下分离胎鼠大脑皮质，离心管中吹散成单细胞，细胞悬浮液接种子T25cm2培养瓶中，摇晃使其分布均匀，置入37℃5%CO2培养箱。2～3d后可见神经球形成，每3天半量更换细胞培养基。（2）NSCs传代：神经球的传代与纯化：离心管装入含悬浮神经球的培养基，室温静置2min。弃上清液，加DPBS洗涤，离心。加0.05%胰蛋白酶消化神经球，以1ml终止消化培养基（含0.1%FBS）终止胰蛋白酶反应。离心，加入NSC培养基，将神经球吹散成单细胞，使分布均匀。贴壁神经干细胞的传代：提前包被好细胞培养皿，确认NSCs大部分贴壁。用DPBS清洗后加入0.05%胰蛋白酶消化，终止消化，适度吹打，室温离心2次，加NSCs培养基重悬细胞。

1.4 NSCs鉴定 包括NSCs的标志—巢蛋白（Nestin）表达的检测及其分化能力检测—TUJ-1/GFAP分别被用作标记分化的神经元和星形胶质细胞。

1.5 人参皂苷Rd、Re与神经干细胞促增殖 细胞传代后NSCs培养基培养≥12h，DMEM/F-12洗去残留的EGF和bFGF。对照组选用空白组（DMEM/F-12，N-2，B-27），实验组在对照组基础上分别加入人参皂苷 Rd、Re的 0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L三 种浓度与NSCs共培养48h，条件37℃、5% CO2培养箱，进行免疫荧光化学染色，分别计算两种人参皂苷不同浓度组与对照组BrdU/DAPI比值。每次实验重复3遍，每种皂苷的每种浓度均设有三个复孔。

1.6 人参皂苷Rd、Re与神经干细胞促分化 单纯用1%FBS诱导分化NSCs作为对照组，选取10μmol/L浓度人参皂苷Rd、Re分别加入1% FBS诱导分化NSCs5-7d作为实验组，比较人参皂苷单体Rd、Re对NSCs分化神经元和星形胶质细胞的效率。TUJ-1/GFAP分别被用作标记分化的神经元和星形胶质细胞，计算Tuj1/DAPI、GFAP/DAPI比例。

1.7 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCs的培养 将孕鼠（12.5d）处死，取胎鼠大脑，剥除脑膜，获得胎鼠大脑皮质（图1A），消化成单细胞，开始以悬浮神经球培养的方式进行扩增培养与纯化（图1B），然后进行神经干细胞单层贴壁培养（图1C）并进行后续实验。

图1 神经干细胞培养（200Í）

2.2 NSCs的鉴定 用DAPI细胞核染，Nestin是NSCs的阳性标记物（图2A）。当NSCs培养基中的EGF、bFGF被1% FBS代替后，NSCs开始分化。5d后，NSCs成功分化为Tuj-1标记的神经元（图2B）和GFAP标记的星形胶质细胞（图2C）。

图2 神经干细胞鉴定（200Í）

2.3 不同浓度人参皂苷Rd、Re对NSCs促增殖作用 通过Brdu免疫荧光染色法，对两种人参皂苷0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L三个浓度组和空白对照组相比较。在NSCs加人参皂苷培养48h后，先取对照组及各人参皂苷组进行DAPI和Nestin染色，与正常培养的NSCs相比，可见Nestin标记阳性的细胞形态变得略细长，但Nestin/DAPI比值均＞99%，说明加人参皂苷处理后及对照组的细胞仍为NSCs。相较于对照组，人参皂苷Rd的0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L三个浓度组及Re的1μmol/L浓度组BrdU染色阳性细胞数比例，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而Re的0.1μmol/L和10μmol/L组与对照组比较，差异无统计学意义（P＜0.05）。人参皂苷Rd、Re促进NSCs增殖的适宜浓度均为1μmol/L，而和Re组相比，1μmol/L的Rd对NSCs促增殖作用更强。见图3，表2。（采用的Nestin和BrdU抗体均为鼠抗）。

图3 不同浓度Rd和Re对NSCs促增殖的作用（荧光染色，400Í）

表2 人参皂苷Rd、Re对NSCs促分化作用 ［%，（x±s）］

2.4 不同浓度人参皂苷Rd、Re对NSCs促分化作用 通过Tuj1和GFAP免疫荧光染色法，比较人参皂苷Rd、Re单体对NSCs分化为神经元及星形胶质细胞的效率。选用1%FBS诱导分化NSCs作为对照组，选10μmol/L人参皂苷Rd、Re，分别联合1% FBS诱导分化NSCs 5～7d作为实验组，计算Tuj1/DAPI、GFAP/DAPI比值。与对照组相比，人参皂苷Rd、Re组Tuj1/DAPI比值无显著性差异，本研究中未发现Rd、Re有促进NSCs分化为神经元细胞作用。和对照组比较，人参皂苷Rd和Re组增加了GFAP阳性细胞比例，人参皂苷Rd和Re均可促NSCs分化为星形胶质细胞，而与Rd相比，10μmol/L的Re对NSCs促分化为星形胶质细胞作用更强，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

中医理论认为肾精不足、髓海空虚是导致脑神失用即神经功能减退的主要原因，使用益气类中药可促进NSCs的增殖分化，从而恢复脑功能。人参是益气类中药的代表，具有增强免疫力、改善记忆力、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳等作用，这源于其含有多种生物活性物质，人参皂苷是其中最重要的部分。人参皂苷Rd是人参主要活性成分之一，具有广泛的药理活性，可改善心脑血管系统、保护神经系统、治疗溃疡性结肠炎、抑制肿瘤细胞生长、延缓衰老等，这些是和中药人参大补元气和益智的作用分不开的。

在分化实验中，发现人参皂苷Rd、Re可促进NSCs分化为星形胶质细胞，未发现人参皂苷Rd、Re对NSCs分化为神经元细胞有促进作用，这可能和选取的皂苷浓度以及实验操作手法不同等有关。有报道星形胶质细胞在大脑中起支持和分隔神经细胞的作用，故Rd、Re可能在支持和分隔神经细胞方面发挥作用［8］。

本研究中，除首次探索Re对NSCs促增殖有效浓度1μm外，还发现人参皂苷Rd三个浓度均能促进NSCs增殖，同时本实验中得出Rd的1μm为促进NSCs增殖的最合适浓度。同一浓度（1μmol/L）Re和Rd相比较，Rd对NSCs促增殖作用更强。另外，已发现 Rb1 比 Rg1 对 NSCs 促增殖作用更强［7］，Rd 和 Rb1均属于原人参二醇型，是否人参皂苷原人参二醇型比原人参三醇型普遍存在促NSCs增殖作用更强，有待进一步实验研究。这个筛选结果为今后研究NSCs从体外转至体内的增殖、细胞移植后的存活以及选择人参皂苷的种类、浓度提供实验基础。

研究表明，PI3K/AKT，MAPK/Mek是常见的几种参与调节细胞增殖、存活、凋亡及分化的信号通路，其中PI3K/AKT信号通路与NSCs增殖密切相关，对人参皂苷的研究基本集中在PI3K/AKT、Mek/MAPK/ERK等通路上。目前，Rd、Re两种皂苷的通路研究大多在其他细胞而NSCs较少涉及。本实验发现Re有调高mAKT1、mAKT2、mMAPK1、mMek、mNFKB、mPI3K表达水平的趋势，Re促进NSCs增殖的机制可能与PI3K/AKT、PI3K/NFKB、MAPK/Mek信号通路的激活有关。本实验结果为mRNA的表达，可在后续研究中进行AKT的蛋白表达和磷酸化水平测定，进一步验证其增殖的机制。另外，有研究证实人参皂苷Re通过抑制脂多糖引起的NFKB信号通路的诱导表达增加，发挥抗炎作用，表明Re促进NSCs增殖可能具有抗细胞凋亡、抗炎等多靶点作用［9］。

总之，是否人参皂苷Rd、Re对NSCs的增殖具有另外的信号通路，抑或是多条信号通路共同起作用，还是中药对NSCs增殖分化信号通路具有综合调控作用，还需做进一步的深入探讨与实验研究。本实验为后期对人参皂苷促NSCs增殖的研究奠定基础，在促增殖机制研究中可根据不同皂苷选择不同的信号通路进一步研究。