高原地区妊娠期高血压产妇胎盘Stat3、Survivin及MMP-2的表达水平及意义

李宗英，赵得熊，张海燕，郝丽娟

（青海红十字医院 1.妇产科，2.耳鼻喉科，青海 西宁 810000）

妊娠期高血压疾病是女性妊娠期的常见并发症，近年来发病率呈逐渐上升趋势，且高原地区发病率高于平原地区[1-2]。关于妊娠期高血压疾病的发生机制尚未有统一定论。有研究证实胎盘中滋养细胞参与妊娠期高血压疾病的发生，胎盘组织中信号传导、转录活化因子3（signal transducers and activators of transcription 3, Stat3）、Survivin及基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）与滋养细胞能力下降密切相关[3-4]。本研究检测高原地区妊娠期高血压患者胎盘组织中Stat3、Survivin及MMP-2的表达，以探究高原环境中妊娠期高血压疾病的发生与3者的联系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年2月—2017年4月在青海红十字医院行分娩的79例产妇作为研究对象。将产妇分为轻中度组、重度组和正常组，分别为30、27和22例。其中，轻中度组产妇年龄19～38岁，平均（28.64±3.21）岁；分娩孕周38～40周，平均（39.69±2.34）周。重度组产妇年龄20～39岁，平均（29.13±3.54）岁；分娩孕周39～40周，平均（39.09±2.16）周。正常组产妇年龄22～39岁，平均（27.86±2.67）岁；分娩孕周38～40周，平均（39.73±3.06）周。纳入标准：①符合《妇产科学》[5]诊断标准；②单胎妊娠。排除标准：①高血压、心脑血管及糖尿病病史；②心、肝、肾及免疫系统存在严重缺陷；③出现胎膜早破、前置胎盘及胎儿窘迫等异常情况。研究对象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集产妇分娩后在无菌环境中剪取脐带根部面积约0.5 m2的胎盘组织，生理盐水漂洗后用纱布吸干水分，一部分放入-80℃冰箱中保存，另一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.2 胎盘组织苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色常规制备胎盘组织石蜡切片，脱水后进行苏木精复染，浸入1%盐酸5 s后水洗，加入伊红染液染色脱水，滴加二甲苯进行透明处理，用中性树脂进行封片，将切片放置显微镜下进行观察。

1.2.3 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）从冰箱中取出保存胎盘组织，采用RNA提取试剂盒提取组织总RNA，采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，反应体系：10×cDNA模板1μl，正反向引物各0.5μl，H2O 8μl，10μl 2×SYBR Mix。反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共计35个循环，72℃继续延伸10 min。运用CFX manager 3.0软件以β-actin作为内参基因按照2-ΔΔCt法进行基因相对定量分析。

1.2.4 免疫组织化学法胎盘组织石蜡切片脱水后置于柠檬酸盐缓冲液中20 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）清洗后，加入3%过氧化氢溶液放置25 min。PBS清洗后，滴加山羊血清反应15 min，加Stat3、Survivin及MMP-2一抗置于4℃冰箱中过夜。PBS清洗后加入二抗，室温下孵育20 min后加入DAB显色液进行显色反应。水洗后，进行苏木精复染，蒸馏水冲洗后置于1%盐酸中5 s后清洗，脱水后滴加二甲苯进行透明处理，用中性树脂进行封片，置于显微镜下进行观察。每张切片挑选10个视野，计算阳性染色细胞数比例，当比例＜5%细胞总数为阴性，比例介于5%～100%为 阳性。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用方差分析，两两比较用SNK-q检验；计数资料以率（%）表示，用χ2检验，进一步两两比较用χ2分割法，检验水准α=0.0125，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胎盘组织HE染色结果

正常组胎盘组织中绒毛血管数量较多且体积小，血管壁均未见异常。轻中度组胎盘中绒毛数量有所下降，且滋养细胞增多形成结节，宫腔变窄，管壁周围出现纤维状坏死。而重度组情况更为严重。见图1。

2.2 各组胎盘中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比较

各组Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P ＜0.05）；进一步两两比较，轻中度组各指标均较正常组下降（P ＜0.05），重度组各指标均较轻中度组下降（P ＜0.05）。见表1和图2。

图1 各组胎盘组织染色结果 （HE×100）

表1 各组胎盘中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比较 （±s）

表1 各组胎盘中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比较 （±s）

组别nStat3SurvivinMMP-2正常组220.85±0.080.89±0.070.81±0.05轻中度组300.72±0.040.74±0.030.68±0.03重度组270.63±0.010.57±0.030.59±0.02 F值121.865312.736251.124 P值0.0000.0000.000

图2 各组胎盘中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA 水平比较 （±s）

2.3 各组胎盘组织中Stat3、Survivin及MMP-2蛋白阳性率比较

Stat3、Survivin及MMP-2阳性细胞主要分布于胞浆中，呈棕黄色。各组Stat3、Survivin及MMP-2蛋白阳性率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P ＜0.05）；轻中度组各指标阳性率均较正常组下降（P ＜0.05），重度组各指标阳性率均较轻中度组下降（P ＜0.05）。见表2和图3。

2.4 各组胎盘和新生儿资料比较

各组胎盘重量、新生儿身高及体重比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P ＜0.05）；进一步两两比较经SNK-q检验，轻中度组各指标均较正常组下降（P ＜0.05），重度组各指标均较轻中度组下降（P ＜0.05）。见表3。

表2 各组胎盘组织中Stat3、Survivin及MMP-2蛋白阳性率比较 例（%）

图3 各组胎盘组织中Stat3、Survivin及MMP-2蛋白表达情况 （×100）

2.5 Stat3、Survivin、MMP-2的相关性分析

Stat3、Survivin及MMP-2相互间及其与胎盘重量、新生儿体重均呈正相关（P ＜0.05）。Survivin与身高呈正相关（P ＜0.05）。见表4。

表3 各组胎盘和新生儿资料比较 （±s）

表3 各组胎盘和新生儿资料比较 （±s）

组别n胎盘重量/kg新生儿身高/cm新生儿体重/kg正常组220.53±0.1152.24±1.683.14±0.51轻中度组300.46±0.0651.16±2.062.47±0.48重度组270.39±0.0450.13±1.471.91±0.34 F值22.6578.61946.006 P值0.0000.0030.000

表4 Stat3、Survivin、MMP-2的相关性分析

3 讨论

高原地区海拔一般＞3 000 m，气候恶劣，紫外线辐射强，高寒缺氧，体内供氧和耗氧常失衡，导致一系列的病理生理改变，例如对血液流变学及血管收缩产生较大的影响，血液易发生浓缩现象且血容量明显降低，这些因素均为妊娠期高血压疾病的发生提供条件[6]。本研究通过检测高原地区产妇胎盘中Stat3、Survivin及MMP-2的表达，试图阐明在高原环境中3者的表达与妊娠期高血压疾病发生的联系。

胎盘病变在妊娠期高血压疾病的发生中起重要作用，有学者认为滋养细胞发生异常是胎盘病变的前提[7]。本研究显示盘中绒毛数量下降，且滋养细胞增多形成结节，血管发育不良，重度组情况更为严重，分析原因可能为母体发生病变的情况下滋养细胞对子宫的侵袭能力下降，导致子宫螺旋动脉功能重塑受阻，血管变窄，绒毛间隙狭窄，进而加重病情[8]。本研究结果显示，妊娠期高血压疾病患者MMP-2 mRNA、阳性表达低于正常分娩者，随着病情程度的增加阳性表达率逐渐降低，可能是MMP-2在滋养细胞中含量下降，使浸润能力受影响，导致绒毛发育不良胎盘病变。细胞外基质降解在滋养细胞侵袭中发挥着关键作用，有研究发现MMP-2等基质金属蛋白酶参与此过程，能够分解胶原、凝胶、黏连蛋白等，且妊娠期高血压疾病者MMP-2蛋白表达低于正常妊娠者[9]。本研究结果与以上研究相符合，提示MMP-2与妊娠期高血压疾病的发生相关。

Survivin属于细胞凋亡抑制因子，在胚胎、胎儿组织中高度表达。Stat3是Stat蛋白家族成员，能够通过信号转导途径对凋亡相关因子进行调控进而促进细胞的增殖、凋亡。相关研究显示Survivin在整个妊娠过程中均有表达，且Survivin在妊娠期高血压疾病患者中水平低于正常者[10]。Stat3水平升高能够激活抑癌基因P21以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表达发挥抗凋亡、促增殖的作用[11]。本研究显示妊娠期高血压疾病患者胎盘中Survivin、Stat3阳性表达率低于正常分娩者，随着病情程度的增加其表达水平逐渐降低。有研究发现，胎盘组织中Survivin表达下降导致细胞过渡凋亡，从而降低胎盘功能，Stat3蛋白表达降低能够抑制滋养细胞侵袭[12-13]。以上研究表明Survivin、Stat3蛋白与妊娠期高血压疾病的发生、病情进展相关。本研究还发现Stat3、Survivin及MMP-2相互间呈正相关，且3者与胎盘重量、新生儿体重呈正相关，说明Stat3、Survivin、MMP-2的表达与胎盘以及胎儿的生长、发育密切相关，可以根据3者蛋白表达对患者病情程度及新生儿预后进行评估。

综上所述，Stat3、Survivin及MMP-2蛋白与妊娠期高血压疾病的发生密切相关，且与病情严重程度及新生儿预后相关，为妊娠期高血压疾病的治疗提供一定的参考，但本研究仅从组织学方面进行检测，其具体生理机制及分子机制还需后续深入研究。