应用介孔分子印迹聚合物萃取粮食中的乙酰甲胺磷

谭钰清，孙梦谣，刘宇婷，张伽宜，李智昊，陈立钢

(东北林业大学 理学院，黑龙江 哈尔滨 150000)

乙酰甲胺磷是农业种植过程使用较多的内吸性有机磷杀虫剂，具有低毒、广谱、高效的特点，当其进入人体后会抑制胆碱酯酶，对人体伤害很大。所以测定食品中乙酰甲胺磷残留至关重要[1-2]。乙酰甲胺磷残留的传统检测方法是采用乙腈提取，再经气相色谱-质谱联用法分析测定，但该方法选择性较差，抗干扰能力弱，萃取率低，分析准确性较低[3-4]。

相较于传统检测方法的不足，本研究引入分子印迹聚合物作为乙酰甲胺磷萃取分离的吸附剂。分子印迹聚合物是一类具有特定功能基团、空穴大小形状的高分子材料，具有稳定性好、选择性高、耐高温高压和酸碱的优点。其模板分子可与聚合物单体接触形成多重作用点，在聚合中被记忆下来；移除模板分子后，在聚合物中留有多个与其空间构型相匹配且对模板分子具有选择识别特性的空穴[5-7]。

传统分子印迹聚合物大多采用本体聚合的方式制备，得到的材料孔径较小，且难以控制，因而吸附容量较低，吸附解吸动力学缓慢。介孔材料是一种具有大比表面积和三维孔结构的新型材料，孔径介于微孔与大孔(2～50 nm)之间，具有孔道结构规则有序、孔径分布狭窄、孔径大小连续可调等特点[8-9]。将其作为分子印迹聚合物的基体，可兼得两者优点，使材料吸附性更好。

本实验采用分子印迹和自组装技术，通过3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和正硅酸乙酯在中性介质下水解、凝聚、缩合，使有机基团与介孔硅胶基体结合，制备一种新的介孔分子印迹聚合物，并通过动力学、热力学和竞争吸附等手段，研究其对乙酰甲胺磷的吸附机理和选择性[10-11]。将其作为基质固相分散萃取的分散剂，结合高效液相色谱法，对粮食中乙酰甲胺磷残留进行分析。该方法可实现乙酰甲胺磷的高选择性萃取分离，且提高了分析速度，节约了有机溶剂用量，具有一定的实际应用价值。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

乙酰甲胺磷(纯度99%)，毒死蜱(纯度99.5%)，草甘膦(纯度95%)，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(纯度99%)，正硅酸乙酯(纯度98%)，正十二烷胺(DDA，纯度95%)，甲醇、乙醇、乙腈、冰醋酸(均为分析纯)，甲醇(色谱纯，仅用于配制流动相)，以上试剂均购于上海阿拉丁；实验用水为纯净水；大米、黄豆、糯米、薏米样品均购于哈尔滨当地超市。

LC-15C高效液相色谱仪配置紫外检测器(日本岛津公司)；FEI Sirion扫描电镜(荷兰飞利浦公司)；ASAP 2020全自动比表面积和孔隙度分析仪(美国Micromeritics公司)；FT-IR360傅立叶红外光谱仪(美国Nicolet公司)；萃取小柱为3 mL聚丙烯固相萃取空柱。

1.2 实验方法

1.2.1 介孔分子印迹聚合物的制备将100 mg乙酰甲胺磷溶于30 mL乙醇和20 mL水中，加入3 mL APTES，常温下均匀搅拌10 h；加入2 g DDA(50 mL乙醇溶解)和6 mL正硅酸乙酯，常温下搅拌反应24 h，用乙醇洗涤并以7 000 r/min离心7 min后，置于真空干燥箱中60 ℃烘干15 h，得粉末状聚合物；用甲醇-乙酸(4∶1，体积比)进行索氏提取56 h，以除去模板分子和致孔剂；置于真空干燥箱中60 ℃烘干24 h，即得介孔分子印迹聚合物(MIP)。

采用同法制备介孔非分子印迹聚合物(NIP)，仅不加入模板分子乙酰甲胺磷。

1.2.2 吸附实验取4 mL 200、160、120、80、60、40、20、10 μg/mL的乙酰甲胺磷标准溶液分别加入10 mg MIP和NIP，于25 ℃水浴恒温振荡24 h，进行等温吸附实验。经滤膜过滤后，用高效液相色谱检测溶液中乙酰甲胺磷的剩余浓度。根据公式Q=(C0-Ct)V/m计算聚合物对乙酰甲胺磷的吸附量(Q)，其中C0为乙酰甲胺磷的初始浓度(mg/L)，Ct为其平衡浓度(mg/L)，V为吸附溶液体积(mL)，m为聚合物质量(mg)。采用Scatchard分析讨论聚合物的吸附情况，拟合方程为Q/Ct=(Qmax-Q)/kd，其中Qmax为最大表观结合量(mg/g)，kd为结合位点的平衡解离常数(mg/L)。

分别在35 ℃和45 ℃下重复上述步骤，进行吸附热力学实验。

取4 mL 200 μg/mL乙酰甲胺磷溶液分别加入10 mg MIP和NIP，于25 ℃恒温水浴分别振荡2～180 min，检测乙酰甲胺磷的剩余浓度，进行吸附动力学实验。

应用乙酰甲胺磷、草甘膦和毒死蜱考察MIP的特异性选择能力。分别取4 mL 200 μg/mL的乙酰甲胺磷、毒死蜱、草甘膦溶液加入10 mg MIP，在室温下振荡24 h，检测溶液的剩余浓度，进行选择性吸附实验。用NIP重复上述步骤。

1.2.3 基质固相分散萃取法提取粮食中的乙酰甲胺磷将粮食样品与MIP按1∶1的质量比混合研磨8 min后，装入萃取小柱中，依次用4 mL乙醇-水(2∶1，体积比)淋洗和4 mL乙腈-乙酸(19∶1，体积比)洗脱，收集洗脱液，氮气吹干后重新溶于1.0 mL色谱流动相中。以乙酰甲胺磷的相对回收率评价萃取效果：相对回收率(%)=(加标样品中乙酰甲胺磷的检测浓度-样品中乙酰甲胺磷的初始浓度)/乙酰甲胺磷的加标浓度×100%。

1.2.4 色谱条件Hypersil ODS2色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水-甲酸(20∶0.5∶80，体积比)，流速为1.0 mL/min，进样体积为20 μL，检测波长为220 nm。

2 结果与讨论

2.1 介孔分子印迹聚合物的表征

图1 介孔分子印迹聚合物的红外光谱图(A)及扫描电镜图(B)
Fig.1 Infared spectrum(A) and scanning electron microscopy image(B) of MIP

MIP的N2吸附-脱附等温线及孔径分布曲线见图2。如图2A所示，其N2吸附-脱附等温线符合Langmiur Ⅳ型曲线，形成了明显的滞后环，表明其介孔丰富。如图2B所示，孔径分布曲线的波峰位于3～4 nm，证明此处为最可几孔径，介孔孔隙最大。仪器检测结果显示，MIP的比表面积为770.52 m2·g-1，最可几孔径为3.99 nm，孔容为1.28 cm3·g-1。

图2 MIP的N2吸附-脱附等温线(A)及孔径分布曲线(B)
Fig.2 Nitrogen adsorption-desorption isotherms(A) and BJH pore size distribution plot(B) of MIP

2.2 吸附等温线的测定与Scatchard分析

测试了MIP和NIP的吸附等温线，发现MIP的吸附等温线随乙酰甲胺磷浓度的变化趋势比NIP明显(图3A)；在相同浓度下，MIP对乙酰甲胺磷的吸附量大于NIP。说明MIP对乙酰甲胺磷的特定识别使其吸附能力增强。

以Q/Ct对Q作图得到Scatchard分析曲线，如图3B所示，MIP拟合为折线型，说明MIP对乙酰甲胺磷的吸附非均一，聚合物的结合位点呈各向异性。两条拟合直线说明该聚合物对乙酰甲胺磷有两种结合方式，计算其截距和斜率[12-13]为：Qmax1=47.03 mg/g,kd1=57.14 mg/L;Qmax2=90.31 mg/g,kd2=188.68 mg/L。该方法制得的介孔MIP对乙酰甲胺磷的吸附总量为137.34 mg/g(Qmax1+Qmax2)，远大于采用传统方法制得的非介孔MIP对有机磷农药的吸附量(27.38 mg/g)[14]。如图3C所示，NIP拟合为直线型，说明NIP对乙酰甲胺磷的吸附均一，聚合物的结合位点呈等价性，由拟合直线的截距和斜率求得：Qmax=35.58 mg/g,kd=208.33 mg/L。通过比较最大表观结合量，说明MIP的结合能力高于NIP。

2.3 吸附动力学曲线的测定

测试了MIP和NIP的吸附动力学曲线，结果显示，MIP的前期吸附速率高，15 min左右达到吸附总量的85%，在40～50 min时达到吸附平衡，快速的吸附平衡表明聚合物中识别位点对乙酰甲胺磷表现出较好的亲和性。前10 min的吸附曲线斜率较大，是由于此时印迹位点空穴较多，粒子内的扩散速度较大；50 min后的吸附曲线较为平缓，可能是由于吸附接近平衡后，印迹位点多被占据，剩余的吸附质浓度较低，粒子内的扩散速度变缓所致。NIP对乙酰甲胺磷的吸附动力学曲线变化趋势与MIP类似，但其吸附量整体低于MIP。

2.4 吸附热力学曲线的测定

MIP和NIP的吸附热力学曲线如图4A、B所示，结果显示MIP和NIP对乙酰甲胺磷的吸附量均随反应温度的升高而降低；相同温度下，MIP对乙酰甲胺磷的吸附量大于NIP。表明MIP对乙酰甲胺磷的吸附为放热过程，低温更利于两者的结合使其吸附能力增强。

分别计算得到25、35、45 ℃下MIP的准二级动力学吸附速率常数分别为8.0×10-7、3.7×10-7、2.0×10-7min-1，并以lnk2对1/T作图，拟合方程为lnk2=-ΔH0/(RT)+ΔS0/R，其中T为温度(K)，ΔH0为焓变(J/mol)，ΔS0为熵变 J/(mol·K)。如图4C所示，lnk2与1/T呈较好的线性关系，由斜率可求得MIP吸附乙酰甲胺磷的焓变为-637.48 J/mol，由截距可求得熵变为18.307 J/(mol· K)。ΔH0为负值表明吸附为放热过程，ΔS0为正值表明吸附为焓推动过程。将ΔH0和ΔS0代入方程ΔG0=ΔH0-TΔS0，计算在25、35、45 ℃下乙酰甲胺磷的ΔG0分别为-6.09、-6.28、-6.46 kJ/mol，ΔG0均小于0，表明吸附为自发过程。

2.5 选择性吸附的研究

考察了MIP和NIP对乙酰甲胺磷、草甘膦及毒死蜱的吸附情况。由于草甘膦和乙酰甲胺磷的结构较为相似，且具有相同的官能团(如羟基和亚氨基)，故以其作为乙酰甲胺磷的结构类似物，此外选用结构差异较大的毒死蜱为参照物。结果显示，MIP对乙酰甲胺磷和草甘膦的吸附率(分别为92%和33%)明显大于NIP(分别为38%和29%)，说明MIP对两者均有良好的选择性吸附；MIP和NIP对乙酰甲胺磷的吸附率最大(分别为92%和38%)，对毒死蜱的吸附率最小(分别为5%和4%)。表明MIP对于模板分子乙酰甲胺磷具有良好的选择性。

2.6 基质固相分散萃取条件的优化

2.6.1 研磨时间与混合物比例的确定将一定比例的MIP和样品混合物分别研磨2～15 min，用相同的溶液淋洗和洗脱，结果显示，MIP的吸附能力随研磨时间的增加而增强；研磨8 min时得到的回收率为94.6%，此后增加研磨时间，回收率无明显增强，故选择最佳研磨时间为8 min。随后将MIP和样品按不同质量比(1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1)混合研磨8 min，淋洗并洗脱，结果表明，当样品和MIP的质量比为1∶1时回收率最大(为96.7%)，故确定两者比例为1∶1。

2.6.2 淋洗剂种类及比例的确定将MIP和样品按上述确定的条件混合，分别用相同比例的乙腈-水、乙醇-水和甲醇-水淋洗并用相同的溶液洗脱，得到回收率分别为35.6%、98.2%和73.4%，因此确定采用乙醇-水为淋洗剂。进一步对乙醇和水的体积比进行优化，发现乙醇含量增多可洗脱更多杂质，但损失的乙酰甲胺磷也增多，使得回收率降低。综合考虑，选择体积比为2∶1的乙醇-水为淋洗剂。

图5 加标大米样品中乙酰甲胺磷的液相色谱图(加标0.05 μg/g)Fig.5 Chromatogram of acephate in spiked rice sample(spiked 0.05 μg/g)

2.6.3 洗脱剂种类及体积的确定将MIP和样品按上述确定的条件混合并淋洗，分别用体积比为19∶1和18∶2的乙腈-乙酸溶液、乙醇-乙酸溶液和甲醇-乙酸溶液洗脱，结果显示采用乙腈-乙酸溶液(19∶1)洗脱得到的回收率最高(达92.9%)，因此选择乙腈-乙酸溶液(19∶1)为洗脱剂。相同条件下，对乙腈-乙酸溶液(19∶1)的体积(1～5 mL)进行了优化，发现洗脱剂体积小于4 mL时回收率较低(<80%)，洗脱剂体积大于4 mL时回收率无明显增长。因此确定洗脱剂的最佳体积为4 mL。

2.6.4 MIP普用性考察在最优条件下分别对大米、黄豆、糯米和薏米中的乙酰甲胺磷进行萃取分离，回收率均能达到90%以上，表明制备的MIP适用于多种粮食中乙酰甲胺磷的萃取。

2.7 分析方法的评价与应用

将制备得到的介孔分子印迹聚合物用于基质固相分散萃取空白大米中的乙酰甲胺磷，萃取条件如“1.2.3”所示，将得到的萃取空白溶液对乙酰甲胺磷标准溶液进行稀释，得到标准系列溶液，然后按“1.2.4”条件进行高效液相色谱检测，得到乙酰甲胺磷的回归方程为A=1 019.9c+19 722(A为峰面积，c为乙酰甲胺磷浓度)，r2=0.998 9，线性范围为0.03～0.3 μg/g，以3倍信噪比计算检出限为0.015 μg/g。空白大米样品中加标乙酰甲胺磷的液相色谱图如图5所示。根据国标[16]可知，乙酰甲胺磷在谷物类中限量值为0.2 mg/kg，其他食品中为0.5 mg/kg，故本方法满足检测要求。

从哈尔滨当地购买大米、黄豆、糯米、薏米4种粮食，采用本方法进行检测，均未检出乙酰甲胺磷。随后对该4种粮食样品在3个浓度下(0.03、0.1、0.3 μg/g)进行加标回收实验，每个样品平行测定3次，得到回收率为92.5%～97.1%，相对标准偏差(RSD)为2.9%～3.7%，表明本方法可用于粮食中乙酰甲胺磷的分离分析。

3 结 论

本文以乙酰甲胺磷为模板分子，采用溶胶凝胶技术制备了介孔分子印迹聚合物，对其进行等温吸附、动力学吸附、热力学吸附及Scatchard分析。结果显示该聚合物对乙酰甲胺磷具有较好的吸附效果。且由于其具有介孔结构，比表面积大，因此对乙酰甲胺磷的吸附量高于传统的分子印迹聚合物。将所制得的MIP应用于基质固相分散萃取粮食中的乙酰甲胺磷，并采用高效液相色谱法进行分析，得到了理想的回收率。该方法将固体样品的萃取和净化在一个体系中同步完成，减少了样品预处理步骤，分离速度快，准确度高，具有一定的实际应用价值。