无岩藻糖修饰曲妥珠单抗的研究进展

雷莎莎 朱红雨 张国华 徐明波 杨仲璠 姚文兵

（1. 中国药科大学生命科学与技术学院，南京 210009；2. 北京双鹭药业股份有限公司北京市重组蛋白及其长效制剂工程技术研究中心，北京 100143）

据2018年最新国家癌症中心发布的数据，乳腺癌位居女性恶性肿瘤发病率首位。根据基因表达模式不同可将乳腺癌分为四个亚型：基底细胞 样（Basal-like type）、HER2过 表 达 型（HER2-overexpressing type）、管腔 A 型（Luminal subtype A）、管腔B型（Luminal subtype B）。不同亚型的乳腺癌常伴有不同的临床特征差异，在复发率和总生存期方面也存在差异［1]。其中，约有15%-30%乳腺癌患者表现为HER2阳性［2-3]，而HER2阳性也意味着肿瘤细胞恶性程度更高、疾病进展速度更快、更易发生转移和复发、预后不佳等临床表现。因此，HER2阳性乳腺癌也被称为“最凶险的乳腺癌”［4]。

1 曲妥珠单抗简介

曲妥珠单抗为抗乳腺癌药物赫赛汀（Heceptin）的活性成分，是首个以人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2，C-ErbB-2）为靶点的人源化单克隆抗体药物。该单抗分子量为148 kD，可选择性地作用于HER2的胞外结构域。赫赛汀最早由罗氏研发，1998年获得美国食品及药物管理局批准上市，用于HER-2阳性乳腺癌的治疗。目前曲妥珠单抗产品已被应用于乳腺癌从晚期到辅佐治疗以及新辅助治疗的各个阶段，能减缓肿瘤发展速度，明显延长患者生存期［5]。

目前中国市场上的曲妥珠单抗产品，只有罗氏生产的赫赛汀，其原零售价格平均为24 500元/支（含量440 mg），而患者一个治疗周期至少需要注射14支，意味着一个治疗周期需要30多万，这一费用对于国内多数患者来说是无法承担的，因此这种治疗方案的经济可持续性引起密切关注［6]。2017年赫赛汀纳入国家医保目录，下调为7 600元/支，这代表着未来对该产品的需求将进一步扩大。2018年3月开始，多地市场出现“药荒”，很多患者由于无法购买到药物而被迫停止治疗。为了打破罗氏赫赛汀对市场的垄断、降低治疗成本、满足市场需求，国内药企纷纷投入到赫赛汀生物类似药的研发中。国家药监局药品审评中心公布的数据显示，目前赫赛汀生物类似药国内临床申报情况如表1所示。除生物类似药，国内药企也加紧自我新药研发，一些靶向HER2的创新抗体药物已申报临床。其中主要是ADC药物（如：齐鲁制药的注射用重组抗HER2人源化单克隆抗体-DM1），也有双特异性抗体（如友芝友的注射用重组抗HER2和CD3人源化双特异性抗体）以及单抗（如：丽珠的重组抗HER2结构域Ⅱ人源化单克隆抗体注射液）等。与生物类似药相比，创新药具有研发和市场双重高风险，只有兼顾临床疗效和价格，才能有望取得市场优势。

作为乳腺癌治疗领域内第一个分子靶向性药物，曲妥珠单抗单药有效率为12%-34%，在和多种化疗药物联合治疗过程中也体现出有协同或相加作用［7]。曲妥珠单抗与铂类、长春瑞滨、多西他赛、环磷酰胺有协同作用，与多柔比星、紫杉醇有相加作用。尽管如此，仍约有40% 的转移性乳腺癌患者表现出对曲妥珠单抗治疗的新生（原发）耐药性，并且大部分HER2阳性患者在经过1年的曲妥珠单抗治疗后，也会产生继发性耐药。此外，HER2低表达、异质表达或可疑表达的患者也均不适合使用曲妥珠单抗进行治疗。

表1 赫赛汀生物类似药国内临床申报情况

曲妥珠单抗与HER2的结合对以HER2上调作为扩增基础的肿瘤细胞具有直接抑制作用。曲妥珠单抗破坏配体非依赖性HER2-HER3二聚体相互作用，导致HER3/PI3K/AKT信号传导的快速抑制，最终引起CDK2抑制剂p27的增加，导致癌细胞的细胞周期停滞［8-10]。此外，曲妥珠单抗还能抑制HER2胞外域脱落［11]。除了直接抑制肿瘤细胞信号传导外，曲妥珠单抗还可以通过抗体的Fc片段介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（Antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。ADCC效应依赖于抗体的Fc部分与先天免疫的免疫效应细胞上的Fcγ受体（FcγR）之间的相互结合来实现，特别是表达FcγRIIIa的自然杀伤细胞，且这种结合受到FcγRIIIa158缬氨酸（V）/苯丙氨酸（F）基因组多态性的影响［12]。Clynes等［13]发现当对曲妥珠单抗的Fc端进行一定修饰后ADCC效应消失，而对小鼠的FcγR进行敲除后，曲妥珠单抗的疗效也显著降低。最近的一项临床研究显示自然杀伤细胞的功能与转移性乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗的效应之间存在相关性［14]。这些报道支持了曲妥珠单抗通过ADCC效应实现治疗效果的事实，并且证实增强ADCC效应可以成为一种潜在的提高曲妥珠单抗治疗效果的方法［15]。

抗体介导的ADCC强弱和许多因素有关，如抗体与抗原的亲和力、抗体与Fc段受体的亲和力、免疫效应细胞的特性等。一般情况下，抗体与抗原或Fc受体的亲和力越高，其介导的ADCC作用越强。因此，对抗体的Fc段进行改造，提高其对Fc受体的亲和力也是提高ADCC效应的一个有效途径。研究发现当完全敲除曲妥珠单抗Fc端N连接寡糖的核心岩藻糖时，低剂量使用即可引起强的ADCC效应［16]。通过敲除曲妥珠单抗的核心岩藻糖来改善其临床疗效也成为一个重要的研究方向。

2 曲妥珠单抗核心岩藻糖的敲除

敲除岩藻糖可明显增强抗体的ADCC效应，其内在分子机制是由于岩藻糖的敲除引起抗体Fc端恒定区构象发生改变［17-19]，导致Fc与NK细胞上的FcγRIIIa结合作用增强，避免血清IgG蛋白与抗体竞争结合NK细胞上的活化Fc受体，从而抑制抗体的 ADCC作用［20-21]。研究表明，α-1，6岩藻糖基转移酶（α-1，6 fucosyltransferase，FUT8）可催化GDP-岩藻糖上的岩藻糖转运到GlcNAc内部，通过α-1，6糖苷键连接，形成Fc段寡糖的核心岩藻糖［22]。FUT8可能是催化岩藻糖 α-1，6连接的唯一关键酶［23]。因此，生产完全无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗可通过构建内源性FUT8基因完全敲除、稳定生产出无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗的特异性细胞株来实现。可通过以下多种方式敲除FUT8基因。

2.1 敲除FUT8基因

Yamane等［24]通过序列同源重组技术成功靶向破坏CHO/DG44细胞系中的FUT8等位基因，产生的FUT8-/-CHO/DG44细胞株可表达完全无岩藻糖修饰的抗体。研究表明，FUT8-/-细胞系产生的抗CD20 IgG1与人类FcγIIIa受体具有很强的结合能力，并显著增强ADCC效应，使ADCC增加到正常CHO/DG44细胞株产生抗体的大约100倍。然而，在实现基因敲除时，发生非同源重组的频率远高于同源重组，这导致同源重组策略耗时且费力［25]。此外，产生完全无岩藻糖修饰的抗体或FUT8基因的完全敲除是可逆的，而重新敲除FUT8基因也成为利用同源重组技术产生FUT8-/-CHO细胞系作为生产抗体的宿主细胞的一大挑战［24，26]。

Mori等［27]使用小干扰 RNA（siRNA）在产生抗体的CHO/DG44细胞系中靶向敲除FUT8，选择凝集素（LCA）进行筛选后，分离得到的细胞系中有60%可稳定表达无岩藻糖修饰的抗体。与正常CHO/DG44细胞株相比，ADCC效应提高100倍以上。此外，该细胞系非常稳定，即使在无血清分批补料培养中也可产生去糖基化抗体。

锌指核酸酶（ZFN）和转录激活物样效应核酸酶（TALEN）技术也可用于破坏 FUT8基因［26，28]。Malphette等［26]在3周内利用ZFN技术破坏FUT8基因，得到了FUT8-/-CHO细胞，并以此细胞生产出完全岩藻糖修饰的抗体，该抗体具有正常的糖基化模式，且没有其他的不利表型。Cristea等［28]通过同时采取ZFN技术和TALEN核酸酶技术实现了FUT8基因的敲除。该技术主要通过序列特异性DNA结合结构域组成的ZFN和TALEN与非特异性DNA核酸酶连接，引起DNA双链断裂，从而进行基因层次的遗传调节。然而，DNA双链断裂易引起非同源末端连接或同源性定向修复出现错误，可能导致基因突变和蛋白质功能丧失［29]。

CRISPR/Cas9基因修饰系统可特异性地进行基因编辑［30]。Rond等［31]通过破坏编码寡糖中FUT8的特殊位点基因，首次证实了CRISPR/Cas9技术可有效用于CHO细胞的基因编辑。此外，以LCA进行筛选测试的结果表明靶向FUT8基因的sgRNAs引起的缺失频率高达99.7%。Sun等［29]使用CRISPR/Cas9技术对CHO细胞进行基因改造，3周内FUT8-/-CHO细胞株的成功率为9%至25%，当使用LCA进行筛选后，成功率可增强至52%。通过基因编辑产生的FUT8-/-CHO细胞系可产生无岩藻糖修饰的治疗性单克隆抗体，而此基因敲除对细胞生长、存活力以及产品质量均未产生不利影响。此外，Grav等［32]使用CRISPR/Cas9技术对FUT8、BAK和BAX进行三重靶向敲除后，得到一个可稳定表达无岩藻糖修饰抗体且表达量明显提高的细胞系。

2.2 其他去除岩藻糖的方法

GDP-岩藻糖作为岩藻糖的转运媒介，为FUT8催化核心岩藻糖基化形成的过程中提供核心岩藻糖底物。GDP-岩藻糖通过两条不同途径合成：从头路径和补救途径。从头路径通过鸟苷二磷酸-甘露糖脱水酶（GDP-mannose-4，6-dehydratase，GMD）将GDP-甘露糖转化成GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖；然后通过鸟苷二磷酸-4-酮-6-脱氧甘露糖异构还原酶（GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose epimerase/reductase，GMER或FX蛋白）将该酮中间体转化为GDP-岩藻糖。补救途径直接将从细胞外来源或从溶酶体分解代谢释放的岩藻糖转运到细胞质基质中合成GDP-岩藻糖，这一转运过程是通过岩藻糖激酶和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶（GFPP）实现［33]。随后，由这两条途径合成的GDP-岩藻糖通过GDP-岩藻糖转运蛋白（GFT）被运输到高尔基体的内腔［34]。

CHO-Lec13细胞由于内源性GMD的缺乏，在GDP-岩藻糖形成中天然缺陷，可应用Lec13细胞作为表达无岩藻糖修饰抗体的宿主细胞系。但从Lec13细胞中分离的单抗显示出多种岩藻糖基化模式，大多数单抗产生50%-70%岩藻糖基化［35]。siRNA技术可成功介导岩藻糖基化途径相关酶FUT8、GMD和GFT的沉默并降低抗体岩藻糖基化的含量［36]。但实验结果表明该敲除过程可能会产生不可预测的脱靶效应，暂时无法顺利产业化［37]。Louie等［38]利用CRISPR/Cas9技术得到FX基因敲除的CHO-K1细胞系，并证实该细胞系能表达完全无岩藻糖修饰的抗体。此外，也可通过GFT基因（Slc35c1）失活或突变阻止抗体在高尔基体中发生岩藻糖基化修饰［39]。通过该方法产生的Slc35c1基因失活的CHO细胞系在无血清悬浮培养条件下的细胞生长速率、活细胞密度和抗体生产力均无改变，且已应用于产生无岩藻糖修饰抗体研究［40-41]。

通过细胞工程和培养基修饰等策略也可以改变抗体岩藻糖基化状态，进而提高ADCC效应。抗体表达的糖基化与其培养条件之间存在复杂的关系，宿主细胞类型、培养基和培养过程等参数会对抗体糖基化产生显著影响。图1总结了不同培养操作条件的影响［42]，具体使用哪一种还需要考虑技术的有效性和实际实施，以及生物制造兼容性和可用性等其他因素［43]。

此外，岩藻糖基化的生化抑制剂［44]、植物细胞作为表达平台［45]、化学酶重塑［46]等方法也被开发用来产生无岩藻糖修饰的抗体。

3 无岩藻糖修饰曲妥珠单抗的临床优势

曲妥珠单抗在乳腺癌治疗中的具有明显的临床疗效。然而，药物的有效性存在局限性［47]。岩藻糖敲除的曲妥珠单抗在体外活性和体内药效学评价上都具有明显的优势，有望在不久的将来取代曲妥珠单抗。

图1 各种培养参数对哺乳动物细胞的糖基化途径中的各种酶和糖核苷酸前体的影响［42]

图2 治疗性抗体诱导的ADCC［48]

3.1 无岩藻糖修饰曲妥珠单抗保留FcγR非依赖性功能

曲妥珠单抗可直接抑制肿瘤细胞的信号传导，并导致细胞周期停滞和增殖抑制。研究表明岩藻糖的敲除不会影响曲妥珠单抗的FcγR依赖性功能。这些功能包括HER2结合，对PI3K途径的瞬时抑制和对肿瘤细胞增殖的持续抑制［49]。

3.2 无岩藻糖修饰曲妥珠单抗避免血浆IgG蛋白的抑制作用

血浆IgG蛋白与抗体竞争结合NK细胞上的活化Fc受体，从而抑制抗体的ADCC作用［50]。无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗对NK细胞上的FcγRIIIa具有更大的亲和力，可避免血浆IgG蛋白的抑制作用。无岩藻糖的曲妥珠单抗的这种对天然IgG干扰的逃避机制，可利于其在临床使用中实现更高的细胞毒性效力，因此低剂量的抗体即有可能产生疗效。

3.3 无岩藻糖修饰曲妥珠单抗体外ADCC效应增加

Suzuki等［51]分别使用健康志愿者和乳腺癌患者的外周血单核细胞作为受体细胞，MCF-7或SKBR-3（2个具有不同HER2表达水平的乳腺癌患者的细胞系）作为靶细胞，以比较曲妥珠单抗和无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗各自的ADCC效应。无论使用健康志愿者组还是乳腺癌患者组的外周血单核细胞作为受体，无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗的ADCC效应明显强于曲妥珠单抗。无论患者的身体情况如何，都可以观察到ADCC效应的增强，即使是自然杀伤细胞数量下降、ADCC效应减弱的化疗组。初步体外实验显示无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗可以提高抗HER2治疗疗效，而且不依赖于患者的疾病治疗情况。

3.4 无岩藻糖修饰曲妥珠单抗的体内疗效增加

为了评估无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗在体内的功效，Junttila等［49]以每周3次10 mg/kg的方案注射曲妥珠单抗或无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗，以评价岩藻糖敲除是否对曲妥珠单抗在抑制SCID-beige小鼠乳腺脂肪垫中KPL-4异种移植物生长的作用。与敲除前相比，无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗更有效地抑制KPL-4肿瘤的生长。此外，接受无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗治疗的小鼠的中位无进展生存期增加一倍以上。其中，曲妥珠单抗的中位无进展生存期为23.4 d，而岩藻糖敲除后的中位无进展生存期为48 d。这些结果表明无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗的体内疗效优于曲妥珠单抗。

3.5 无岩藻糖修饰曲妥珠单抗的临床适应症增加

TrasGEX是针对糖基化部位进行改造所得的第二代曲妥珠单抗产品，与传统曲妥珠单抗相比，TrasGEX的N-聚糖只含有少量岩藻糖。TrasGEX与NK细胞上FcγRIIIa受体的结合亲和力更高，且在充分保持其结合力的同时可增强ADCC效应。TrasGEX可引起所有高HER2和低HER2表达乳腺癌FcγRIIIa供体细胞的ADCC效应，因此具有更广谱的杀伤作用。目前正在进行I期剂量递增研究以确定可用于II期研究的最佳剂量和方案，并评价TrasGEX的安全性，药代动力学和初步抗肿瘤活性［52]。体外和体内研究表明，对传统曲妥珠单抗耐药的乳腺癌细胞仍保留了对ADCC杀伤效应的敏感性［53]。提高无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗用药剂量可以改善HER2阳性患者治疗过程中出现的耐药性（原发性或继发性）。此外，无岩藻糖修饰曲妥珠单抗未来也可能用于有可疑、异质或低HER2表达的乳腺癌患者，这可能是由于其具有显著的ADCC效应。这表明无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗有着更广泛的患者群体和更大的市场。

4 单抗Fc段其他改造方法的探索

除了目前研究比较成熟的Fc段N连接寡糖的核心岩藻糖敲除外，研究者也探索出了其他针对曲妥珠单抗Fc段进行改造的方法，期望能够改善其ADCC效应。

Nordstrom 等［54]设 计 出 了 MGAH22， 一 种与曲妥珠单抗具有类似特异性和亲和力的嵌合抗HER2单克隆抗体，其Fc结构域被改造以增加与人FcγRIIIa-158V/V基因型的外周血单核细胞的结合，而该基因型相比其他不同基因型的外周血单核细胞可引起更强的ADCC效应。Fc结构域改造后得到的抗体可更强地引起所有进行考察的HER2阳性肿瘤细胞的ADCC效应和抗肿瘤细胞增殖活性，且这种效应的提升对于那些低HER2表达水平的细胞也同样适用。此外，MGAH22在转入人FcγRIIIa-158F（F/F or V/F）基因的小鼠中表现出更好的靶向HER2表达性肿瘤的活性。而在一项使用食蟹猴的单一和重复剂量毒理学研究中，MGAH22在所有考察剂量下都具有良好的耐受性（15-150 mg/kg），且药代动力学参数与其他抗HER2抗体相似。体内与体外实验均表明，MGAH22在诱导细胞因子释放方面与大多数的野生型mAb或曲妥珠单抗能力相似。这些数据为MGAH22进入后续临床开发提供了有利证据，且其可用于具有低HER2表达肿瘤或携带FcγRIIIa低结合等位基因的患者。

Jo等［55]利用大肠杆菌内膜表达系统，通过定向改造结合随机突变策略改造IgG的非糖基化Fc区，得到保留了与FcγRIIIa的结合能力并且可以有效发挥ADCC效应的非糖基化Fc突变体。改造之后，利用流式细胞术进行多轮高通量筛选分离出与曲妥珠单抗相比具有更高FcγRIIIa亲和力的非糖基化抗体 Fc突变体AglycoT-MG48和AglycoT-MG59。尽管AlycoT-MG48和 AglycoT-MG59的 FcγRIIIa亲 和 力高于曲妥珠单抗，但ADCC活性低于糖基化IgG抗体。与曲妥珠单抗相比，非糖基化改造Fc突变体的ADCC活性较低，可能是由于对FcγRIIb的结合亲和力增加。FcγRIIb是一种通过抑制免疫细胞活化以抑制抗肿瘤活性的抑制性受体。尽管已有的实验结果不是非常理想，然而通过进一步改造以降低与抑制性FcγRIIb受体结合能力的操作，有可能产生表现出更好的ADCC效应和肿瘤细胞杀伤活性的非糖基化Fc突变体曲妥珠单抗［55-56]。

Chen等［57]通过对Fc结构域进行改造得到可与FcγR接触的额外环结构，通过构建编码这些环中片段内所有可能的氨基酸多样性的文库，从而筛选富集得到具有改善低亲和力FcγRIIIa结合活性的突变体。其中非糖基化IgG1突变体DTT-IYG在各个评价模型中均可有效地替代野生型Fc。且理论上由于DTT-IYG不需要糖基化就可有效地与FcγR结合，因此此类抗体的表达系统得以扩展。

在改善抗体Fc突变体与FcγRIIIa亲和力时，其相应的表达量以及生物物理特性，如稳定性、血清半衰期、免疫原性等也需要纳入考虑。此外，Fc突变体能否介导ADCC活性的增强才是决定该变体是否进行下一步研究的关键。从其成药性来看，需要从非临床和临床研究等多方面进行评估。

5 结语

曲妥珠单抗用于HER2阳性乳腺癌的治疗的安全性和有效性已毋庸置疑。然而，药物的有效性存在局限性。抗体翻译后糖基化的研究为抗体细胞毒性作用提供了新的研究思路，通过对抗体Fc段改造，特别是核心岩藻糖的敲除可以显著增强曲妥珠单抗ADCC效应。

无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗不仅可以改善HER2阳性患者治疗过程中出现的耐药性，也可能用于有可疑、异质或低HER2表达的乳腺癌患者，从而扩大适应症范围，这对于改善乳腺癌患者群体的治疗效果具有非常重要的意义。因此，完全无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗，未来值得作为新一代降低剂量、提高疗效的抗体治疗应用于患者，这将对基于ADCC机制的人类肿瘤治疗产生巨大的影响。尽管关于曲妥珠单抗核心岩藻糖的敲除已经具有很多相关报道，但都存在一定的局限性，如岩藻糖敲除不彻底或完全敲除后可逆、容易引起基因突变或蛋白功能丧失、细胞株表达不稳定、耗时耗力、成本高等。如何经济有效地产生完全无岩藻糖修饰的曲妥珠单抗是目前急需解决的一大问题。