嗜盐菌生物合成聚羟基脂肪酸酯（PHAs）的研究进展

张梦颖 李雅慧 詹元龙 刘长莉

（东北林业大学生命科学学院；哈尔滨 150040）

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHAs）是微生物体内碳源和能源的贮藏物质，当碳源丰富而其他营养元素（N/P/S 等）不足时，会在不同的微生物体内合成［1-3]。截至目前，陆续发现了约150种不同的PHA单体，并且新的单体还在不断地发掘中［4]。PHA单体结构的多样性主要区别于C-3位上侧链基团的不同，其中单体碳原子数3-5是短链PHA（SCL PHA），碳原子数在6以上是中长链PHA（MCL PHA）。PHA的结构通式如图1所示，R可以是烯基、苯环和烷基等，通常m为1，n表示聚合度，决定聚合物分子量大小［5-6]。以侧链为甲基的聚3-羟基丁酸（PHB）最为常见。聚3-羟基丁酸（PHB）具有与聚丙烯类似的热塑性，并具有脆性和较差的热稳定性；聚羟基丁酸-co-羟基戊酸共聚物（PHBV）与PHB相比，具有更好的强度、硬度，更大的弹性，更低的熔点［7-8]。短链PHA呈现出的是硬结晶体；中长链PHA是有热塑性的弹性体，柔韧性好、硬度低，结晶速率慢，熔融温度大多保持在39-61℃范围内［8-10]；短链中长链共聚的PHA（SCL-MCL PHA），通过调整单体比例，得到结合短链和中长链优异性能的共聚PHA材料［10]。嗜盐菌（Halophiles），是可以生活在高盐度环境中的菌株，自1972年Kirk和Ginzburg首次提出嗜盐菌积累PHA［11]，越来越多可生物合成PHA的嗜盐菌被发现。

为了使PHA的生产达到规模化，科研工作者从多方面试验。目前微生物发酵法是生物合成PHA的主要途径，合成PHA的微生物主要分为3类：纯菌、工程菌和混合菌。在生物合成PHA过程中，存在灭菌成本高、高淡水消耗、不连续发酵易污染等缺点，导致工业生物技术与化学工艺相比竞争力较低［12]。由于嗜盐菌能够在较高温度、高pH、高NaCl浓度下正常生长，在无灭菌条件、连续发酵情况下无杂菌污染，且固定资本的投资低，可进行工业化持续生产［12]，又可通过细胞裂解回收聚合物，既简化处理技术又降低成本［13-14]，并且，基因工程改造已经开发了嗜盐菌的方法，利用分子生物学手段提高PHA产量。因此，开发嗜盐菌生物合成PHA的研究有重要的意义。本文结合课题组前期的研究工作，综合国内外最新研究动态，对嗜盐菌生物合成PHA的研究现状进行阐述，并对今后的发展动态进行展望。

图1 PHA的结构［5]

1 嗜盐菌的生物特性及分类概述

嗜盐菌又被称为需要盐（NaCl）生长的微生物，可在真核生物、古菌及细菌3个不同的领域探寻到嗜盐微生物的身影［15]。嗜盐菌遍及在地球上各种高盐的地理区域，如盐湖、盐沼和盐田等［16]。研究表明，嗜盐菌可以从不同层面进行分类。Kushner等通过嗜盐微生物对盐浓度的不同需求，将其分为轻度嗜盐菌、中度嗜盐菌、边缘极端嗜盐菌、极端嗜盐菌及非嗜盐菌5类［13]，这是相对较早且较细化的分类方式；Oren等又根据嗜盐菌生长最佳盐浓度的不同，将嗜盐菌大致分为中度嗜盐菌和极端嗜盐菌［14]；Quillaguamán等［15]在原有分类基础上，将嗜盐微生物概括为：弱嗜盐微生物，中度嗜盐微生物（NaCl 3%-15%，W/V）和极端嗜盐微生物（NaCl 15%以上，W/V）［16]。尽管分类数目不同，但定义各类别嗜盐菌适宜的盐浓度范围大致相同，如中度嗜盐菌的最适生长盐浓度为0.5-2.5 mol/L；极端嗜盐菌的最适生长盐浓度为 2.5-5.2 mol/L［17]。

在高盐高渗透压下，嗜盐菌具有可以适应的生存机制。第一种机制是积累无机离子（主要是KCl）以平衡渗透压；第二种机制是积聚低分子量的水溶性有机化合物，作为相容溶质或渗透剂，保持细胞内低的盐浓度［18-19]。这两种机制的存在促使嗜盐菌可区别于普通菌在高盐环境下正常生长。

2 嗜盐菌生物合成PHA的分类

2.1 野生型嗜盐菌生物合成PHA

在嗜盐菌的纯菌种生物合成PHA的研究中，研究者从自然界分离、纯化可产PHA的嗜盐菌，然后在不同条件下进行产PHA实验。在碳源丰富、氮源限制营养不均衡的条件下，极端嗜盐古菌Halobacterium mediterranei和H. volcanii.可积累PHA；而嗜盐小盒菌属marismortui在营养充足的培养基上，积累的PHA占细胞干质量的21%。当H.halophila在适宜的盐浓度（NaCl 60 g/L）下，PHA合成量高达3.68 g/L，占细胞干质量的82%［20]。极端嗜盐古菌Natrinema ajinwuensisRM-G10在利用发酵罐分批重复培养72 h，PHA积累量占细胞干质量的61%［21]。嗜盐菌的纯菌种生物合成PHA，是开发其基因工程菌的研究基础。相对生活在中性环境下可产PHA的微生物，嗜盐菌的纯菌种在工业生产中避免杂菌污染可降低生产成本，使嗜盐菌在和其他微生物的竞争中占有优势，这也是很多学者不断开发利用嗜盐菌生物合成PHA的原因。

2.2 嗜盐菌的基因工程菌生物合成PHA

在嗜盐菌合成PHA的过程中，有很多基因起着至关重要的作用，如Tan等［22]敲除盐单胞菌TD01的phaP基因导致PHB的合成量下降（由88%下降至72%），敲除phaC1基因又使其丧失合成PHB的能力，这些基因都直接影响PHB的产量。因此，与PHA合成相关的基因被认为是工业生产中有前途的候选基因［12，23]。运用基因工程技术，构建嗜盐菌的工程菌，敲除抑制或降解PHA合成的相关基因，过表达促进PHA合成的相关基因［22]，尝试通过分子生物学技术降低PHA的生产成本，提高PHA的产量。

野生型H. campaniensisLS21以模拟的厨房废物为底物合成PHA，PHA的积累量占细胞干重的26%；然而将基因phbCAB重组到野生菌H.campaniensisLS21中，构建其工程菌，PHA的积累量占细胞干质量的70%［24]；Fu等［25]通过敲除盐单胞菌TD01中编码2-甲基柠檬酸合酶的基因，使得PHA的共聚物PHBV的产量占细胞干质量的70%。

Tan等［22]以TD01为出发菌株，成功地开发了采用未灭菌、连续发酵的方式生物合成PHA的平台。为提高该平台的稳定性，部分地抑制盐单胞菌TD01的DNA甲基化系统，构建具有高拷贝数、稳定的、共轭的质粒pESVA131，以包含Laclq-Ptrc系统，从而实现多途径基因的诱导表达；又通过使盐单胞菌TD01染色体内缺失2-甲基柠檬酸合成酶和3个PHA解聚酶，构建出新型嗜盐菌株TD08，苏氨酸合成途径中的苏氨酸脱氢酶的过表达使重组盐单胞菌TD08能够产生聚（3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯）或PHBV。细胞分裂抑制剂MinCD在盐单胞菌TD08细胞生长的稳定期过表达时，导致细胞的长度较原始长1.4倍，PHB积累量从69 wt% 增加到 82 wt%，这在提高PHA产量的同时也会诱导细胞沉淀，简化产物的下游处理工艺。Chen等又通过将编码4-羟基丁酸酯辅酶A转移酶的基因orfZ整合到野生型Halomonas bluephagenesisTD01中，构建出TD01的又一基因工程菌，新构建的工程菌在开放的非无菌条件下，以葡萄糖和 γ-丁内酯为碳源的培养基上，产生聚（3-羟基丁酸酯-4-羟基丁酸酯）共聚物；在1000 L的发酵罐中扩大培养时，48 h内共聚物的细胞干重为83 g/L，PHA积累量占细胞干质量的 61%［26]。

综上所述，我们能清晰地看到嗜盐菌的工程菌株高产PHA的潜力。但又因适于盐单胞菌科的高效转化方法是接合转化，在嗜盐菌构建基因工程菌方面，需针对特定的细菌，调整供体-受体菌比例，明确接合时间，优化复苏培养基，才更适于嗜盐菌基因工程菌的构建与优化［27]。因此，在野生型嗜盐菌的基础上，通过先进的分子生物学技术，构建工程菌，从而大幅度提高PHA的合成量，是有价值、有潜力的研究方向。

3 嗜盐菌生物合成PHA的影响因素

3.1 发酵条件对嗜盐菌生物合成PHA的影响

嗜盐菌多是专性好氧化能异养型［28]，在PHA合成过程中，摇瓶培养或发酵罐培养都会提供充足的氧气，即保持高转速（160-210 r/min）下培养［20，22，24，29]。Wang 等［29]从大庆地区的盐碱土壤中筛选出嗜盐细菌Halomonassp. DQ-4，500 mL的锥形瓶装液量为100 mL时，摇瓶培养48 h，PHA产量达4.3 g/L，而当装液量为200 mL时，PHA产量仅为2.76 g/L。Chen课题组使用500 L发酵罐，300 L的工作体积，培养基的起始葡萄糖25 g/L，NH4Cl33 g/L，尿素2 g/L，在37℃、空气流速1.5 m3/h、pH维持在8.5-9.0的条件下，细胞干重达83 g/L，PHB含量占细胞干重的80%［22，26]。综上，在嗜盐菌生物合成PHA过程中，依据实验中所涉及菌株的生长特性，通过发酵条件优化，将可高产PHA的条件确定为最适合本菌株的发酵条件，这既保证嗜盐菌最好的生长状态，又能提高 PHA 的产量［20，22，26，29]。目前，本实验室也在探究发酵条件对嗜盐菌生物合成PHA的影响，经初步实验分析，在最适的温度、转速、装液量、pH、培养温度等发酵条件下，可以提高PHA的合成量。

3.2 NaCl浓度对嗜盐菌生物合成PHA的影响

嗜盐菌为维持细胞壁的完整性需要在高盐的环境下生存［30]。NaCl的浓度不仅为维持细胞壁完整性，影响PHA的合成量，而且对PHA聚合物的分子量（Mw）和热性能（Tm，Td）也有影响；不同浓度的NaCl，熔融温度（Tm）越高分解温度（Td）越低［20，32]，但总体而言，不同浓度NaCl产生的PHA样品的分解温度（Td）在247-262℃之间，熔融温度（Tm）都在180℃左右（表1），这与Koller提出的由其他有机体产生的高分子量PHA样品的Tm值在 180℃左右相对应［20，31]。

嗜盐革兰氏阳性杆菌Bacillus megateriumuyuni S29在0.5% 的 NaCl下，PHA合成量为 1.17 g/L；4.5%的NaCl下，PHA合成量为2.22 g/L；10% 的NaCl下，PHA 合成量为 0.72 g/L［32]。Halomonas halophila在 6%的NaCl下，PHA合成量为3.68 g/L；10% 的NaCl下，PHA合成量为1.48 g/L。因此，不同的嗜盐菌其最适NaCl浓度不同，NaCl的浓度能直接导致PHA合成量不同。所以，由嗜盐菌生物合成PHA时，探究最适的NaCl浓度是必要的。

表1 H. halophila在不同NaCl浓度下所产的PHA物理性质和分子量［20]

Halomonas halophila在 2% 的 NaCl下， 合 成PHA聚合物的热稳定性最高，10% 的NaCl下，聚合物热稳定性较低，Td值浮动在3.8-14.2℃间（见表1）。我们在利用嗜盐菌生物合成PHA过程中，调节NaCl的浓度，可以控制聚合物的分子质量，如H. halophila在低的盐浓度下（2%或4%），生物合成的PHA分子量较其在高盐度下低；在较高的盐度下（6%、8%或10%），会产生高分子量的聚合物［3]。因此，NaCl浓度对嗜盐菌生物合成PHA的热稳定性和分子量有一定影响。

综上，嗜盐菌作为出发菌株进行产PHA实验时，产物的结晶度（Xc）、熔融温度（Tm）、分解温度（Td）影响着未来成品的耐热性、耐低温性、耐冲击性、成型性等。选择最适的盐浓度，既避免盐添加的过多或不足，又可获得产量高、材料性能好的PHA［3，20]。

3.3 不同碳源对嗜盐菌生物合成PHA的影响

碳源作为PHA合成过程中必不可少的营养元素，随着对嗜盐菌合成PHA研究的深入，截至目前发现，嗜盐菌可利用鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、纤维二糖、木糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、木质纤维素、糖蜜及羧甲基纤维素钠等作为碳源［20，29，33]。其中，H. halophila以鼠李糖为碳源时，PHA 产量是 4.98 g/L［29]。H. halophila虽不能直接利用乳糖，但可利用经酸催化水解后产生的干酪乳清作为碳源，其PHA的积累量达3.26 g/L。此外，嗜盐菌还可利用锯末（SWD）和玉米秸秆（CS）的水解产物，而玉米秸秆的水解产物在稀释一次后作为基底物，细菌生长不良、PHA无积累；再经二次稀释后，出现良好的生物质和PHA效价［23-34]。利用玉米秸秆作为碳源时，通过简单稀释水解产物就可以很容易被嗜盐菌利用。因此，嗜盐菌是一个强大的细菌菌株，在未来的工业化生产中，有不可忽视的优势。

虽然葡萄糖是最好利用、最易转化的糖类，但在实验中，当生物体利用葡萄糖时，就发现对其他糖的零利用；相反，在以其他碳源取代葡萄糖的条件下，不同的糖以相同速率消耗的或多或少，如当以锯末水解物代替葡萄糖时，嗜盐菌会优先利用木糖［20]。

廉价碳源的开发利用，我们看到了嗜盐菌的发展潜力。在降低底物成本的同时，又减少环境污染。采用最优的方式处理可再利用的废物，减少资源占地空间，避免资源浪费。在我国东北地区，玉米秸秆可谓是遍地可见，焚烧处理会污染空气，浪费资源。而上文提及的经简单的二次稀释，玉米秸秆可被嗜盐菌再利用进行生物合成PHA［20]。这一办法的实施，秸秆被有效利用，避免处理过程中污染环境；又生物合成PHA，这在废物再利用的同时又创造出新的生物资源。

4 结语

当微生物处于营养不均衡的条件下，作为储备碳源而在细胞内聚集积累的高分子生物聚酯，即聚羟基脂肪酸酯。PHA作为生物塑料，其推广式生产应用，将节约石化资源，减少环境污染，实现资源的可持续发展。随着对PHA研究的深入，嗜盐菌作为可产PHA的菌株已成为国内外研究的热点。

由嗜盐菌作为出发菌株进行生物合成PHA的实验，其优势有：（1）嗜盐菌适宜生长在高盐高碱的环境，这在菌的发酵实验中省略了繁琐复杂的灭菌过程，可降低生产成本；（2）在可产PHA的野生型嗜盐菌的基础上，尝试通过分子生物学手段来提高PHA的合成量，是有价值、有潜力的研究方向；（3）对于不能进行产PHA的野生型嗜盐菌，尝试通过分子生物学手段进行产PHA实验。

自嗜盐菌产PHA被发现至今，已有将近50年，嗜盐菌作为较其他产PHA的菌株，研究仍较少，这可能与其在生长过程中最适碳源的选择、氮源的添加以及工程菌株构建方面的培养条件还不完善等方面有关。但是，随着科学技术的发展进步，生物研究方法的更新换代，由嗜盐菌生物合成PHA的形态、分子量、动力学参数和生物技术特性等研究可能会带给我们很多意外收获。综上所述，嗜盐菌作为产PHA的优势种，其有着菌株本身的优势，也有很多待探究的优势。因此，我们对由嗜盐菌作为出发菌株进行产PHA的实验应抱有持续关注的态度，积极探究的好奇心，从而促使嗜盐菌在生物塑料合成及其他副产品开发等方面有更加显著的成果。