聚乙烯醇降解细菌筛选及其降解特性

刘亚兰 段梦洁 林晓珊 张毅

（华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510000）

聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA），是一种人工合成的白色或微黄色片状、颗粒或粉末状固体材料。由于其自身存在非常优异的水溶性、乳化性、耐油脂性等性能，所以在造纸业、印染业、食品包装、安全玻璃生产等行业中均得到了大范围的应用，而且每年世界上对PVA的需求也在不断增加，产量快速增长［1]。随着世界环境保护议题的逐渐加深以及可持续发展理念的实行，有必要筛选出具有高效降解PVA的菌株，并研究其降解机理，使得在不同工业环境下产生的PVA废水或者PVA固态废弃物能够加速降解，以减轻生态环境负荷。

聚乙烯醇是当前世界上为数不多的生物可降解高分子材料，如在真菌和放线菌作用下可以实现对PVA的快速降解，其中以细菌中的假单胞菌和鞘氨醇单胞菌居多，而假单胞菌是当前发现最早的可降解PVA的微生物。1973年，Suzuki等［2]在研究中得到了一株能够将聚乙烯醇完全降解的菌株PseudomonasO-3，自此聚乙烯醇的可生物降解性越来越受到人们的关注。1983年，Shimao等［3]研究发现了可以降解聚乙烯醇的微生物菌群，主要分为两大类，第一类由Pseudomonassp.组成，它们自身能够分泌出大量可降解聚乙烯醇的酶，其发挥降解作用需要吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）作为辅助因子，另外钙离子和镁离子在酶的作用过程中也起重要作用；第二类则由Pseudomonassp.和Alcaligenessp.共同组成，Alcaligenessp.主要负责为Pseudomonassp.的生长提供必要的生长因子。1999年，Matsumura等［4]在研究中发现了一株Alcaligenes faecalisKK314，该菌株以聚乙烯醇作为唯一的碳源，它能够分泌出胞外聚乙烯醇脱氢酶（Polyvinyl alcohol dehydrogenase，PVADH），通过PQQ以及氯化钙的辅助实现降解功能。Liu等［5]发现Bacillus amyloliquefaciens在有一定量酵母粉的摇瓶优化条件下，可以更加高效地利用聚乙烯醇。当前研究发现，许多微生物对聚乙烯醇材料的独立降解速率仍然较低，有些对生存环境的要求也相对较高［6]。为了加速环境中废弃PVA的降解，发掘新的可快速降解聚乙烯醇降解菌株，并研究其相关降解特性、探究其降解机理，是非常有必要的。

影响聚乙烯醇材料生物降解的内部因素包括聚乙烯醇材料本身的聚合度和醇解度。通常认为，聚乙烯醇材料的聚合度越高，材料所需要的降解时间就越长。Corti等［7]学者发现PVA的醇解度相比于聚合度对微生物的降解能力有较大影响，但也有学者用类产碱假单胞菌降解不同型号的PVA时发现，当聚合度一定时，醇解度对PVA降解率的影响并不明显［8]。

本研究将PVA泡棉材料经过3年的堆肥后，利用Finely法从中筛选出可高效降解PVA的菌株，通过形态学观察及16S rRNA测序、进化树分析对其进行了鉴定；使用红外光谱分析了不同降解期限内PVA泡棉的内部结构特征；利用紫外分光光度计每48 h检测培养基中PVA的降解率以及菌体OD600，同时对比了4株菌对不同醇解度的PVA的降解速率的影响，旨为PVA降解菌株的应用以及聚乙烯醇生物降解机制研究提供一定的参考理论。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料及样品 聚乙烯醇：PVA1788，聚合度 1 700，醇解度88%，灰分含量低于0.7%；PVA1799，聚合度 1 700，醇解度99%，灰分含量低于0.7%，两者均购自台湾长春化工有限公司；聚乙烯醇泡棉：长15.0 cm、宽10.0 cm、厚度2.0 cm，由PVA1799制成，重量约50.0 g，含水量70%，由台湾东海大学张有义教授提供。

1.1.2 培养基 LB培养基g/L：蛋白胨10.0，酵母膏粉5.0，NaCl 5.0，葡萄糖1.0，pH 7.0±0.2。

LB琼脂培养基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母膏粉5.0，NaCl 5.0，葡萄糖1.0，琼脂15，pH 7.0±0.2。

筛选培养基（g/L）：PVA1799 0.5，NH4NO30.1，K2HPO41.6，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05，CaCl20.05，FeSO4·7H2O 0.02，NaCl 0.02，琼脂 15.0，pH 7.0-7.2。

基础培养基1：PVA1788 3.0 g/L，酵母粉1.0 g/L，其余同筛选培养基。

基础培养基2：PVA1799 3.0 g/L，酵母粉1.0 g/L，其余同筛选培养基。

1.1.3 主要试剂及仪器 显色剂：A：4.0 g/L硼酸溶液；B：KI-I2溶液储备液：KI 2.5 g/L，I21.27 g/L。革兰氏染色液，广东环凯微生物科技有限公司；细菌DNA提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit，DP302），天根生化科技（北京）有限公司；PCR 扩增相关试剂，TaKaRa 公司；PCR 仪（Mastercycler X50），德国 Eppendorf 公司；紫外分光光度计 UV-2000，美国尤尼柯公司；恒温培养摇床 THZ-300，上海一恒科学仪器有限公司；真空冷冻干燥机FD-1B-50，上海仙象仪器仪表有限公司；傅里叶红外光谱仪Nicolet 6700，赛默飞世尔科技分子光谱部；ZEISS扫描电镜，德国卡尔蔡司股份公司。

1.1.4 堆肥来源 本研究中的堆肥从君得生物科技有限公司购买，主要组成为：鸡粪52.02%（W/W），稻草28.45%（W/W），含水率 68%（W/W），pH 6.73。

1.2 方法

1.2.1 PVA泡棉的堆肥实验 将聚乙烯醇泡棉剪裁成3.5 cm× 2.0 cm× 1.0 cm的小长方块样品若干，置于装有一定量堆肥的收纳箱中，使其均匀分布，总深度大约10.0 cm，随后将收纳箱放在室温条件下避光存储［9]。整个堆肥过程每2 d在其表面喷洒适量无菌水，以保证堆肥的湿度。

1.2.2 PVA降解菌株的筛选分离 取经堆肥作用3年的PVA泡棉样品若干，去掉样品表面的残存堆肥，称量3 g已降解几近为粉末状的聚乙烯醇泡棉，置于装有无菌生理盐水的锥形瓶中，在37℃、150 r/min条件下震荡30 min，使材料表面的微生物充分洗脱下来，从中取50 μL 液体接种于筛选培养基平板上，均匀涂布后置于37℃生化箱恒温培养，待到平板菌落不再增多时（6 d），挑取平板上的菌落，利用LB培养基进行富集。由于定型滤纸片可以使菌体更好地附着在平板上，且有利于直观查看透明圈效果，故使用直径约1.5 cm的灭菌滤纸片将LB培养液内的菌体接种在筛选培养基平板上，连续培养6 d，然后对其开展Finley透明圈实验，通过观察透明圈大小判定微生物对聚乙烯醇的降解能力［10]。对于产生较大透明圈的菌株，进行纯化分离及菌株保藏（与甘油混合后，置于-80℃冻存），并进行形态学观察。

1.2.3 Finley透明圈实验 将显色剂A与显色剂B进行4∶1混合［11]，从中取出3 mL滴加在平板上，轻轻晃动使其均匀覆盖整个平板，避光处理10 min［12]后观察显色结果。

1.2.4 聚乙烯醇降解菌株的鉴定

1.2.4.1 菌落形态及细胞形态观察 在LB琼脂培养基上将4株菌培养12 h后，观察并记录菌落形态，同时用无菌接种环在平板上挑取适量菌体进行革兰氏染色。另外取经LB液体培养基培养12 h的适量菌液，经戊二醛固定、乙醇梯度脱水和临界点干燥后，进行电镜扫描。

1.2.4.2 细菌DNA的提取 取在LB培养基中37℃恒温培养24 h的菌体培养液10 mL，在6 000 r/min、4℃条件下离心5 min，取沉淀部分，按照细菌提取试剂盒操作说明进行DNA提取。

1.2.4.3 PCR扩增 从细菌16S rDNA片段中选择V1-V9区，以通用扩增引物实现对样品DNA的扩增 处 理［13]， 以 F27（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）作为上游引物，R1429（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）为下游引物。具体操作为：将样品在94℃条件下预变性2 min；然后在94℃下继续处理30 s；将温度调为50℃处理30 s；升温至72℃处理2 min，按照这个操作循环处理30次；最后在72℃条件下延伸10 min。上述处理完成之后，从上述样品中取出5 μL扩增产物与1 μL 6×Loading Buffer进行混合，上样置于1% 的琼脂糖凝胶中，在电压120 V下电泳处理30 min。电泳结束后，将凝胶放在3×Gelred核酸染料中染色10 min，最后将凝胶置于凝胶成像系统来对PCR扩增效果进行验证。

上机测序：PCR样品经过纯化之后，样品测序由广州艾基生物技术有限公司进行。

数据分析：根据得到的DNA序列，通过Blast进行比对，然后下载相似菌株及相邻物种的DNA序列，通过Clustal W对比其序列，以MEGA 7.0.26来建立系统发育树［14]。

1.2.5 PVA标准曲线测定 标准溶液制备［15]：取PVA为5.0 g/L 的基础培养基，通过不含PVA的培养基将其进行稀释，得到含PVA为0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 g/L的培养基，将这6个不同浓度PVA的培养基作为标准溶液。OD值测定：将上述标液与显色剂B、A按照2∶2∶6的比例进行反应［11]，同时将不含PVA的基础培养基与KI-I2、硼酸溶液进行反应作为空白，避光处理15 min，在其最大吸收峰波长处［PVA1788（495 nm）；PVA1799（500 nm）]测定上述反应液对应的OD值，每组试验平行测试3次，然后根据得到的数据，以PVA浓度作为横坐标，OD值为纵坐标，得到本次试验的标准曲线［12]。

1.2.6 分离菌株对PVA1788/99的降解 取各菌株在LB培养基中培养12 h的发酵液，按1% 接种量接种于基础培养基1和2中，每48 h对培养基中PVA浓度、活菌浓度进行测定。摇瓶培养条件均为37℃、150 r/min；活菌浓度在OD600条件下测定；本文中所有实验均设置3个平行，并取其平均值。

发酵液离心：6 000 r/min条件下对各发酵液离心5 min，获取上清液。

OD值测定：利用1.2.5中OD值的测定方法来测定每个样品与显色剂反应后的OD值，并经标准曲线方程计算得PVA浓度，经公式1-1计算得PVA的降解率。

其中，C0代表培养基中最初的PVA浓度；Ct代表时间t时刻下培养基中PVA的浓度。

1.2.7 傅里叶红外光谱分析 将堆肥0个月（初始PVA泡棉）、3个月、2年、3年的PVA泡棉取出，用无菌水清洗3次，经真空冷冻干燥机处理12 h。取适量冷冻干燥后的样品研磨至均匀粉末状，沾取适量溴化钾［16]后利用傅里叶红外光谱仪进行测试。测试范围为400-4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1。

2 结果

2.1 PVA降解菌株的分离鉴定

2.1.1 透明圈产生结果 图1显示的是各菌株在筛选培养基中形成的透明圈，相同培养条件下，形成的透明圈尺寸较大且界面清晰，可初步说明该菌株具有较好的PVA降解能力。

2.1.2 菌落及细胞形态观察 在LB琼脂培养基上将4株菌培养12 h后，DG01的菌落直径大小约为8.9 mm，DG02的菌落直径大小约为12.2 mm，且两者的菌落形态结构相似，即菌落中心较湿润，边缘较整齐且干燥，菌落呈米黄色，表面有明显的细丝状痕迹；DG03和DG04的菌落直径约为1 mm，菌落边缘整齐，半透明，有明显的光泽，乳白色。

图1 各筛选菌株产生的透明圈

根据革兰氏染色结果，DG01、DG02均属于革兰氏阳性杆菌，DG03、DG04为革兰氏阴性杆菌。由扫描电镜图（图2）可看出，DG01与DG02菌体为椭圆棒状，大小分别约为1.36 μm×2.50 μm和1.40 μm×3.20 μm；DG03和DG04菌体为长杆状，大小分别约为 0.83 μm×2.70 μm 和 0.90 μm×2.85 μm。

2.1.3 微 生 物16S rRNA鉴 定 结 果 在DG01、DG02、DG03和DG04菌株中，其16S rDNA片段长度依次为1 384、1 355、1 340和1 381 bp，非常接近一般的16S rDNA长度（1 540 bp），这也充分说明了测序结果的真实性。进一步经过Blast序列比对可知，DG01、DG02、DG03和DG04依次与Bacillus thuringiensisBM-BT15426、Bacillus thuringiensisBMBT15426、Paenibacillus pabuliSW12、Paenibacillus pabuliSW12的同源性达到100%。以Clustal W来比对下载的相似菌株及相邻物种DNA序列，并通过MEGA 7.0.26来建造系统发育树，结果如图3所示。可初步确定DG01、DG02菌株为Bacillussp.DG01（Accession No.MK208524）、Bacillussp. DG02（Accession No.MK208525），DG03、DG04菌 株 为Paenibacillussp. DG03（Accession No.MK208526）、Paenibacillussp. DG04（Accession No.MK208527）。

2.2 PVA泡棉的红外表征

本实验使用红外技术对经过不同堆肥时期的PVA泡棉进行分子结构检测，结果如图4所示。由图可知，堆肥3个月与初始PVA泡棉在特征区及指纹区产生峰的位点大致相同，因此可知聚乙烯醇泡棉的分子结构没有发生明显的变化。通过分析堆肥2年的PVA泡棉红外图谱可知，图谱中没有了甲基基团，而在2 780.94 cm-1处存在一较强的峰，在1 720.54 cm-1，1 411.15 cm-1，1 241.56 cm-1处 也 有较强的吸收峰，说明其中存在羧基；另外，指纹区在691.30 cm-1处出现了较强峰，表明堆肥在降解的过程中形成了新的羟基。观察降解3年材料的红外光谱可发现，在2 780.74 cm-1处有一强烈峰，对应指纹区在1 719.43 cm-1，1 419.30 cm-1，1 236.27 cm-1处存在较强峰，表明系统中存在羧基；同时在690.26 cm-1处存在较强峰，说明也产生了新的羟基。

图2 各筛选菌株的扫描电镜结果

图3 基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树

2.3 分离菌株对PVA1788/99的降解

2.3.1 标准曲线的绘制 采用1.9中PVA标准曲线测定方法后，得到PVA1788溶液的标准曲线为：Y1=0.15X1+0.018，R2=99.79%， 方 程 中X1代表 PVA1788浓 度，Y1为 OD值，PVA1788浓 度与λ=495 nm处各标准反应液OD值呈良好的线性关系；得到PVA1799溶液标准曲线方程为：Y2=0.22X2+0.018，R2=99.65%，PVA1799浓 度 与λ=500 nm处各标准反应液OD值呈良好的线性关系。

2.3.2 PVA1788/99的降解与菌体生长关系 图5显示的是四株细菌对PVA1788/99的降解率及菌体浓度变化曲线。在8 d的降解过程中，DG01、DG02、DG03和DG04对PVA1799的降解率依次为58.27%、54.47%、43.32%和46.59%，对PVA1788的降解率分别达到67.27%、74.99%、56.74%和59.7%。四株菌对PVA1788降解率明显高于对PVA1799的降解率，说明低醇解度的PVA更有利于微生物的降解。从图5-B、5-D可以看出，在0-2 d，PVA1799基础培养基内活菌浓度增长最快，对应的PVA1799的降解速率也达到最快，说明各菌株对PVA1799的降解能力主要受到菌体增殖速率的影响；从图5-A、5-C可以看出，在0-2 d，DG01、DG02和DG04处于对数增长期，对应的PVA1788降解速率最快，DG03菌体的对数增长区间是在0-4 d，其对应的PVA1788降解速率上升区间也是在0-4 d，说明了PVA1788消耗和菌体的个体生长也呈相关关系。另外，图5-B、5-D显示，在2-8 d时，当PVA1799基础培养基中的活菌浓度有所下降直至稳定状态时，PVA1799的降解速率也开始下降并逐渐趋于稳定；从图5-A、5-C可看出，在2-8 d时，DG01、DG02和DG04的菌体浓度趋于稳定，PVA1788的降解速率曲线也趋于平缓，而DG03的菌体浓度稳定时期和PVA1788的降解速率趋稳时期则是4-8 d。以上结果表明，对于PVA1788/99的降解，4株菌的菌体生长与PVA1788/99的降解率变化趋势密切相关；除DG03对PVA1788的降解率增长区间在0-4 d外，其余3株菌对PVA的降解率最快时期和自身增长对数期都在0-2 d。此外，从菌种属来看，属于Bacillussp.的DG01和DG02对PVA1788/99的降解率要普遍高于属于Paenibacillussp.的DG03和DG04。

图4 不同堆肥期中PVA泡棉材料的红外吸收比对图

3 讨论

目前发现的能够降解PVA材料的菌株主要分布于Pseudomonas，而属于Bacillus及Paenibacillus的只有少数，根据学者 Chio等［17]的研究可知，通过将Microbacterium barkeriKCCM10507与Paenibacillus amylolyticusKCCM10508两种菌株按照一定的比例进行混合，能够实现对污水中聚乙烯醇的快速降解。另外，Mori等［18]在1996年从污泥中分离到一株Bacillus megaterium，其必须在与PN19共同培养的情况下才能降解聚乙烯醇。本研究通过3年的实验室条件堆肥之后，利用以PVA1799为唯一碳源的基础培养基，从已降解的PVA泡棉材料中筛选出了可独立降解PVA的高效菌株，该菌株在8 d内对3 g/L PVA的降解率最高可达74.99%，且不需要添加PQQ、金属离子等促生长因子，可独立进行PVA代谢，具有一定的开发价值和应用前景。

红外光谱图可用于研究分子的结构和化学键，由物质分析得到的红外谱图可反映出物质所含的官能团种类，结合特征谱和指纹区的分析即用来表征和鉴别化合物。经过3年的堆肥后，PVA泡棉已由原来的块状变为几近粉末状，另有少量碎块。在实验所得的红外图谱中发现，相比堆肥3个月的PVA泡棉与原始PVA泡棉材料，两者在特征区及指纹区产生峰的位点比较相似，这就意味着堆肥前后材料的分子结构不会出现明显的改变，继而说明短时间的堆肥对PVA泡棉的影响作用不大，可对其产生降解作用的微生物可能还未富集到能对PVA泡棉产生明显降解作用的程度。而经过2年和3年堆肥期的PVA泡棉材料的红外图谱显示，甲基基团消失，同时伴随着新的羧基和羟基的产生，Chen等［19]学者在研究混菌对PVA1799的降解作用时，也发现了降解后的PVA1799出现了新的羟基等基团。新的官能团的出现，说明PVA泡棉分子结构的改变，继而说明微生物菌体对其产生了降解作用。

在PVA1788/99的降解研究过程中，所使用的基础培养基仅以PVA作为碳源，未添加其他的碳源物质，因此4株菌只能够利用PVA为碳源来满足自身生长及代谢需求。由PVA降解速率与菌体浓度变化曲线图分析可知，PVA材料的降解与菌体的生长、增殖过程存在着紧密的联系。在菌体的对数生长期，培养基中的PVA浓度较高，营养物质较为丰富，此时菌体生长较快，对PVA的代谢也比较旺盛，降解速率最快；而在菌体生长平台期，菌体的增长率降低，PVA的代谢速率随之减慢。从图5可看出，PVA1788/99的降解率在菌体生长的对数期时已达成近2/3，剩下的1/3则是在菌体生长平台期达成，可见菌体生长平台期时PVA降解效率明显低于生长对数期。此外，当PVA的聚合度同为1 700时，筛选出的4株细菌对PVA1788和PVA1799的降解效果显著不同，说明醇解度在一定程度上影响到PVA的降解效果。在研究中得到的菌株Bacillussp.DG01、Bacillussp.DG02、Paenibacillussp.DG03、Paenibacillussp.DG04对PVA1788的降解速率整体上比PVA1799快，说明在聚合度一定时，较低醇解度的PVA更易被微生物分解利用。

图5 筛选菌株及菌株浓度变化及菌株对PVA1788/99降解率的影响

大多数学者认可的PVA降解机制为［20]：PVA长链上两个相邻羟基发生脱氢反应生成氧化型PVA，接着氧化型PVA的长链结构再被水解为短链，短链再发生脱氢，再经水解为更短的短链，不断循环，最终生成CO2和H2O，在此降解过程中，可产生乙酸和甲基酮类物质［21-22]。结合菌体生长曲线及PVA的降解率情况及红外图谱，作者推测，菌体在对数生长期时通过自身分泌的酶将PVA长链切割为短链进而利用，但随着短链的不断循环切割，原来以1，3-二醇键形式连接在主链上的羟基可能以新的键型出现，并在碳原子上连接了新的羧基或者其他基团，而菌体对新的羟基和羧基等基团的适应性不够，或者自身分泌的酶无法对这些新的基团再进行作用，所以菌体的生长受到限制。要使菌体生长代谢进一步提高，可尝试对菌体进行长期驯化使其能够利用不同类型的PVA的切割短链。

4 结论

本研究经堆肥实验，筛选出了4株具有独立降解PVA1788/99效果的细菌，即Bacillussp.DG01（Accession No.MK208524）、Bacillussp. DG02（Accession No.MK208525）、Paenibacillussp. DG03（Accession No.MK208526）、Paenibacillussp. DG04（Accession No.MK208527）。4株细菌对低醇解度的PVA1788的降解率要高于PVA1799，菌体的生长代谢与PVA降解率的变化密切相关。经过2年、3年堆肥，PVA泡棉原来的甲基消失，产生了新的羟基和羧基。

致谢：

本实验中所用的聚乙烯醇泡棉材料由中国台湾东海大学张有义教授提供，在此表示衷心的感谢。