钙依赖蛋白激酶CPK14在花粉管生长中的功能分析

周利明 卢鑫蕊 马声葳 房玮

（华北理工大学生命科学学院，唐山 063210）

花粉管是一类研究细胞极性控制和生长的理想模式系统。作为雄配子体，花粉管通过极性生长快速通过雌蕊组织，将精细胞定向输送到胚珠［1-2]。在这一过程中钙离子发挥重要作用，生长中的花粉管顶端区域可以检测到Ca2+浓度梯度（Ca2+浓度从顶端向下逐渐递减）［3]。细胞外Ca2+的流入在很大程度上导致了花粉管生长过程中Ca2+梯度的形成，另外动用内质网中储备的Ca2+，也有助于梯度的形成。人为干扰正常的Ca2+梯度可以导致花粉管生长的中止，去除干扰因素（重建正常的Ca2+梯度）可以恢复正常的花粉管极性生长［4]。利用花粉管模式系统研究钙信号途径，有助于进一步揭示植物细胞极性发育的调控机制，并对提高作物育性具备一定的现实意义。

Ca2+信号的传递有赖于下游的Ca2+传感器，其中包括钙依赖蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinase，CPK）。以往的研究在矮牵牛花中鉴定出两种CPK（PiCPK1和PiCPK2）。PiCPK1定位于质膜，其过度表达导致花粉管顶端膨胀，并伴随Ca2+浓度的过量堆积［5]。拟南芥基因组编码34个CPK，其中CPK14与CPK32过量表达可以导致严重的花粉管去极化生长［6-7]。CPK17和CPK34功能缺失突变体的花粉管生长速率显著降低，大多数都无法正确定位胚珠并使其受精［8]。CPK11和CPK24通过激活一个K+通道（SPIK1）来调节花粉管生长中的K+流入［9]。

ROP（Rho-related GTPase from plants）是植物中的信号转导小G蛋白，控制着多种细胞类型的极性生长，包括花粉管、根毛和叶片铺板细胞等［10-12]。ROP存在两种形式：GTP结合的活性形式和GDP结合的非活性形式，两者的转变由多种上游因子严格调控。已发现的ROP上游调控因子包括GTP酶激活蛋白（GAP）、鸟苷解离抑制因子（GDI）和鸟苷交换因子（GEF）。GTP结合的活性ROP在GAP的作用下，可以有效地进行GTP的水解，从而产生GDP结合的无活性ROP。而GEF可以促进GDP与GTP的替换，将ROP恢复成GTP结合的活性态。只有质膜上的ROP才可以被GEF激活，胞质中的ROP与GDI结合，处于无活性状态。因此，GDI和GAP是ROP的负调节因子，而GEF则被认为是ROP的正调节因子［11-13]。

烟草中的GAP1（NtGAP1）定位于亚顶端质膜，其过量表达诱导生长迟缓的花粉管表型，导致尖端狭窄的短小花粉管。这些结果表明NtGAP1可以将ROP的活性限制在花粉管的顶端区域［14]。对于拟南芥中的GAP1（AtGAP1），其过量表达可以抑制花粉管生长中的ROP1活性。然而，敲除AtGAP1不会导致花粉管明显的去极化生长表型，这表明AtGAP1可能在顶端ROP活性的调节机制中发挥次要作用［15]。目前，拟南芥中存在14个GEF，序列分析显示它们都包括一段功能未知的保守结构域（DUF315）。GEF1、GEF8、GEF9、GEF12 及 GEF14的过量表达可以造成不同程度的花粉管生长缺陷。其中，RopGEF1所诱导的花粉管去极化生长表型最为显著［16]。

尽管花粉管极性发育的相关研究不断深入，但小G蛋白ROP1调控花粉管顶端钙梯度的机理仍需进一步的拓展。本研究通过构建Ca2+传感器CPK家族中CPK14的瞬时表达载体，并转化烟草，统计花粉管的表型及定位分析，确定CPK14的生物学功能及与ROP1信号途径的相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥（Arabidopsis thalianaL.）生态型为Columbia-0，培养于22℃的温室内（16 h光照/8 h黑暗）。烟草（Nicotiana tabacum）的培养温度为28℃，光周期为12 h/12 h。载体构建相关试剂（RNA提取试剂盒、高保真酶、限制性内切酶及dNTP等）购于Takara。烟草瞬时表达相关试剂（金粉及易裂膜等）购于Bio-Rad公司（Bio-Rad，U.S.A.）。质粒提纯试剂盒（Plasmid Mini Kits）购于QIAGEN的产品。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的构建 以6周龄的拟南芥花朵为材料，通过总RNA的提取及反转录反应获得cDNA。设计引物（上游引物：5'-GGATCCATGGTAGATTCTGACCCG-3'，下游引物：5'-GGATCCCCGACGTCGTATGTACTT-3'，下划线处为BamHⅠ酶切位点）。以cDNA为模板，通过PCR扩增获得CPK14片段，随后连入T-vector并测序。测序正确的目的片段通过酶切连接至瞬时表达载体（pBLAT：GFP）。相对于全长CPK14，组成激活型CPK14（CA-CPK14）只保留了蛋白激酶区域（313个氨基酸残基），缺少C端调控区域及钙调素样区域。CA-CPK14采用相似的载体构建流程，最终连接至瞬时表达载体，用于基因枪的瞬时转化试验。

1.2.2 花粉管瞬时表达试验 在每次试验前收集成熟的烟草花粉，每组转化试验大约需要8朵烟草的花粉（悬浮于烟草花粉培养液中备用）。通过质粒提纯试剂盒（Plasmid mini kits）提取用于基因枪瞬时表达的质粒，按照先前描述的粒子轰击试验程序进行相应的操作［17]。轰击完成的花粉粒于28℃培养3 h，然后进行相应的花粉管表型及亚细胞定位观察。

1.2.3 花粉管表型统计与定位分析 对于花粉管表型的分析，转化成功的花粉管在荧光显微镜（BX51；Olympus）下进行观察与拍摄（Olympus CCD摄像机，DP70）。获得的试验图片通过蔡司LSM图像浏览器（3.2版）的测量功能，测量花粉管的长度和最宽端部的直径。每组转化试验设3次重复，并进行t检验。对于花粉管的亚细胞定位分析，转化成功的花粉管在共聚焦激光扫描显微镜（蔡司LSM 510 meta，488 nm激发和505-530 nm发射）下进行相应的观察与拍摄。获得的共聚焦图像由蔡司LSM图像浏览器（3.2版）进行分析。

2 结果

2.1 CPK14在花粉中高量表达

目前，拟南芥中已证实的钙依赖蛋白激酶（CPK）有34个，本文重点关注那些在成熟花粉中优先表达的CPK（推测其最有可能参与花粉管生长的调控途径）。通过对genevestigator基因芯片数据进行表达图谱分析，发现8个花粉高量表达CPK，分别是CPK14、CPK16、CPK17、CPK20、CPK24、CPK26、CPK32和CPK34（图1）。这些CPK都是在成熟花粉粒中高度表达，但在其他组织中相对弱表达或完全不表达。通过花粉管瞬时表达体系，对花粉高量表达的CPK进行初步功能筛查。结果显示，过量表达CPK14可以造成严重的花粉管生长缺陷，即长度缩短且宽度增加，形成一个肿大的花粉管顶端（图2-图 4）。

2.2 持续激活的CPK14抑制花粉管的萌发与生长

基于前期的CPK14相关研究成果，为了进一步探究CPK14在花粉管极性生长中的功能，构建了组成激活型（Constitutively active，CA）的CPK14（CACPK14）。CA-CPK14缺少C端调控区域（钙调素样区和自抑制区），仅仅保留了蛋白激酶区。因此，CACPK14表现出不受Ca2+调控的持续激活特征。带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的CA-CPK14通过基因枪技术在烟草花粉中进行瞬时表达，结果（图2-图4）显示，CA-CPK14瞬时表达可以全面抑制花粉管的萌发与生长。一方面转化CA-CPK14的花粉萌发率仅为43%，显著低于89%的对照组萌发率；另一方面萌发出的花粉管表现出短小的表型，即花粉管的长度显著缩短（对照组：386.63 μm；试验组：42.64 μm），而顶端宽度与对照没有显著差异。

2.3 持续激活的CPK14抑制ROP1的活性

通过CA-CPK14与GFP-RIC4ΔC（活性ROP1的标记物）的共同表达试验，从活性ROP1在花粉管顶端质膜（PM）的分布和积累两个方面，分析CACPK14的加入是否对ROP1的活性造成一定的影响。如图5所示，单独表达GFP-RIC4ΔC的花粉管中荧光信号主要集中在顶端的质膜，而CA-CPK14的表达降低了GFP-RIC4ΔC的顶端质膜定位，但增加了GFP-RIC4ΔC在胞质中的积累（图5-图6）。

在荧光信号的分布范围方面，将顶端最宽直径以上的花粉管表面定义为顶端生长区域，荧光信号范围与顶端生长区域的比值作为GFP-RIC4ΔC分布的量化指标。量化结果（图7）显示CA-CPK14对GFP-RIC4ΔC在花粉管的分布存在一定的抑制作用。基于CA-CPK14对GFP-RIC4ΔC荧光强度与分布的抑制作用，说明CPK14可以部分抑制ROP1在花粉管顶端质膜上的活性。

3 讨论

钙依赖蛋白激酶CPK14在成熟花粉中高量表达，而在其他组织中较少表达（图1），暗示了其在花粉萌发或生长中可能发挥重要作用。基于基因枪瞬时表达体系，单独表达GFP空载的花粉管表现出典型的极性生长特征（细长而均匀的圆柱形花粉管），而CPK14过量表达可以引起花粉管生长极性的部分丧失，产生顶端膨大的花粉管表型（促进细胞膨胀）。另外持续激活型的CPK14（CA-CPK14）在花粉中瞬时表达可以抑制花粉的萌发及后续的极性生长，产生短小的花粉管表型（抑制细胞膨胀）。作为一类蛋白磷酸酶，CPK14过量表达与CA-CPK14瞬时表达都可能导致其下游底物的过度磷酸化，但实验结果却展现出相互对立的花粉管表型。这些结果暗示CPK14可能不是直接作用于花粉管生长相关的关键因子，而是通过中间组分间接调控这些生长因子。

图 1 花粉高量表达CPK在各组织中的表达热图

图2 CA-CPK14过量表达所造成的花粉管表型

图3 CA-CPK14过量表达对花粉管长度的影响

图4 CA-CPK14过量表达对花粉管宽度的影响

图5 CA-CPK14的表达可以抑制GFP-RIC4ΔC在花粉管质膜上的分布与强度

图7 CA-CPK14对 GFP-RIC4ΔC定位分布影响的量化分析

本文提出一个理论模型用于揭示CPK14涉及的花粉管顶端生长机理（图8）。其中，F代表调控花粉管极性生长的关键因子（Key factor），其活性的高低决定了花粉管极性生长的快慢。N与P分别是调控关键因子F活性的负调节子（Negative regulator）与正调节子（Positive regulator）。N与关键因子F可以在细胞质中结合为复合体（N-F），以维持F的非激活状态，抑制花粉管顶端膨胀。N的磷酸化导致N-F复合体解离，生长关键因子F得以释放。P激活花粉管顶端质膜的生长关键因子F（激活的F表示为F*），促进花粉管顶端膨胀。在这个模型中，N可以结合并抑制关键因子F的活性。当N被CPK14磷酸化会促进关键因子F的释放。因此，过量的CPK14可以导致花粉管极性的部分丧失（花粉管顶端膨大）。

CPK的主要结构区域有激酶区（Kinase domain）、钙调素样区（CaM-like domain）和自抑制区（Auto-inhibitor）。钙调素样区中存在4个Ca2+的结合位点（EF-hand结构），Ca2+的结合可以释放CPK的自抑制作用，发挥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的活性［18-19]。因此，CPK既是Ca2+感受器（可逆结合Ca2+），也是一个效应因子（激酶活性磷酸化下游靶蛋白）。CA-CPK14缺少自抑制区，仅保留激酶区域，表现出持续激活的激酶活性。CA-CPK14依照上述模型，同样会导致负调节子N的磷酸化，释放关键因子F，造成生长极性的丧失。然而，如图2-图4所示，CA-CPK14对花粉管的长度和萌发却产生了显著的抑制作用。正常生长中的花粉管顶端存在一个Ca2+浓度梯度（顶端Ca2+浓度最高），全长CPK14与CA-CPK14的关键区别在于C端Ca2+调控区域的有无，因此，含有Ca2+调控区域的全长CPK14受到顶端Ca2+梯度的严格调控，只有在顶端的生长区域发挥磷酸化作用，释放关键因子F。而缺少Ca2+调控区域的CA-CPK14不受顶端Ca2+梯度的限制，在花粉管的各个区域都可释放关键因子F，F分布到整个花粉管质膜，而不是集中在顶端生长区。P作为F的正调节子，只在花粉管顶端质膜的生长区发挥作用。由于F被稀释到整个质膜，导致顶端生长区（唯一存在P激活F的地方）F的相对减少，从而导致花粉管生长的抑制现象。

图8 CPK14调控花粉管极性生长的模式图

ROP类小G蛋白已被证实是花粉管生长的关键因子（相当于模型中的F），调控细胞极性的建立与维持［1-2，13，20]。CA-CPK14 的表型类似于 GAP1（ROP1的负调控因子）的表型。采用一个活性ROP1的标记物（GFP-RIC4ΔC，GFP-RIC4ΔC在花粉管顶端的荧光分布情况可以反映出有活性ROP1的分布情况［21]）。结果显示CA-CPK14可以显著抑制活性ROP1在花粉管顶端的分布，暗示CPK14可以通过ROP信号途径发挥负反馈抑制的作用。CPK14可能通过磷酸化鸟苷解离抑制因子GDI（相当于模型中的N）导致ROP-GDI复合体的解离，释放游离的ROP。富集到顶端质膜的ROP进一步被鸟苷交换因子GEF（相当于模型中的P）激活，从而推动花粉管顶端生长。该研究初步揭示了拟南芥CPK14在花粉管极性生长中的功能，CPK14与ROP信号途径的互作研究将进一步阐明CPK14的调控机理。

4 结论

本研究发现8个花粉高量表达CPK，其中CPK14在花粉中表达极高，而在其他组织中几乎不表达。CPK14的过量表达可以引起花粉管生长的极性丧失。组成激活型CPK14全面抑制花粉管的萌发与极性生长。