青海牦牛乳脂肪Sn-2位脂肪酸组成分析

冯西娅 张 玉 索化夷 王洪伟

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400700；2.西南大学食品科学与工程国家级教学示范中心，重庆 400700)

牦牛乳脂肪中主要含有棕榈酸(28%～34%)、油酸(21%～37%)和硬脂酸(9%～19%)[1]。相对于其他牛乳脂肪，牦牛乳脂肪中含有较高含量的功能性脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)[2]。目前，中国关于牦牛乳的研究[3-4]多是针对其蛋白质特性及总脂肪酸组成，但对牦牛乳甘油三酯的Sn-2位脂肪酸组成未有研究。甘油三酯是由1个甘油分子和3个脂肪酸分子组成，脂肪酸在甘油三酯中的位置分布是影响脂肪营养的重要因素，决定着甘油三酯的吸收代谢及油脂的应用价值[5]。甘油三酯Sn-2位脂肪酸分析可以帮助研究人员有效地剖析其结构，对牦牛乳的利用及产品营养学功能分析具有一定的科学参考价值[6]。

本试验拟通过胰脂肪酶对甘油三酯Sn-1，3位进行专一性水解，将Sn-1，3位置上的脂肪酸游离出来，经薄层层析分离得到甘油一酯[6]。再利用气相色谱分析方法研究牦牛乳脂肪的Sn-2位脂肪酸组成，以期为牦牛乳的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

牦牛乳脂肪：采自青海地区海拔2 000，2 500，3 000，3 500 m处的牧民家；

37种C4～C24脂肪酸甲酯混标：产品编号18919-1AMP | SUPELCO，美国Sigma-aldrich公司；

猪胰脂肪酶：3万U/g，重庆市钛新化工有限公司；

胆酸钠、柱层析硅胶、氢氧化钾、氯化钙、甲醇、乙醚、石油醚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)：分析纯，重庆市钛新化工有限公司；

无水乙醚、石油醚：色谱纯，重庆市钛新化工有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

气相色谱仪：GC-2010型，配备电子捕获检测器(ECD)及氢火焰离子化检测器(FID)，日本岛津公司；

超声波清洗机：SB-3200DTDN型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

旋转蒸发仪：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂；

高效薄层层析硅胶板：GF254(20 cm×20 cm)型，北京贝洛生物科技有限公司；

硅胶柱：柱长30 cm，内径2 cm，重庆市钛新化工有限公司；

薄层色谱展开缸：200 mm×200 mm，上海信谊仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 牦牛乳脂肪甘油三酯的制备 采用硅胶柱分离法。硅胶30 g，用石油醚调成糊状填充层析柱。取牦牛乳脂肪1 g，溶于15 mL三氯甲烷，加入层析柱，然后用300 mL洗脱液(石油醚—乙醚混合溶液，体积比9∶1)洗脱，流速1.0～1.5 mL/min。收集液用旋转蒸发仪减压除去溶剂，得纯甘油三酯，供气相色谱分析使用。

1.2.2 牦牛乳甘油三酯脂肪酸组成测定 根据文献[7]，修改如下：取100 mg牦牛乳脂肪甘油三酯，装入5 mL 离心管，加入石油醚—乙醚(体积比1∶1)混合溶液2 mL，适当振摇，40 ℃水浴40 min。再加氢氧化钾—甲醇(0.4 moL/L)溶液1 mL混匀，40 ℃水浴静置30 min。沿瓶壁加入1 mL蒸馏水，静置，待分层后，吸取上清液并稀释10倍利用气相色谱仪检测。

1.2.3 胰脂肪酶水解甘油三酯方法 根据文献[8]，修改如下：称取纯化过的甘三酯0.1 g于50 mL离心管中，加入胰脂肪酶40 mg及Tris-HCl缓冲液(pH 8)4 mL，摇匀1 min；依次加入2 g/L的胆酸钠溶液1 mL及220 g/L的CaCl2溶液0.4 mL，摇匀1 min；后置于40 ℃恒温水浴锅1 min 并不断摇动；在40 ℃，18 kHz，80 W超声波清洗机中超声2 min，加入6 mol/L的盐酸1 mL并摇匀，加入乙醚1 mL，摇匀，吸取上清液。经薄层层析分离，显色确定甘一酯位置；刮取甘一酯，用乙醚提取后除去溶剂。

1.2.4 Sn-2位脂肪酸分析方法 对甘一酯进行甲酯化后经气相色谱分析牦牛乳脂肪的Sn-2 位脂肪酸组成及含量。根据脂肪酸甲酯混合标准品的保留时间确定脂肪酸的组成成分，并用面积归一法确定各组分的相对含量。

1.2.5 脂肪酸分布的测定或计算 以甘油三酯总脂肪酸和甘油三酯Sn-2位脂肪酸组成为基础，通过式(1)计算一种脂肪酸结合在甘油三酯Sn-2位的含量占其总量的比例[9]。

(1)

式中：

c——脂肪酸结合在甘油三酯Sn-2位占比，%；

m1——甘油三酯Sn-2位脂肪酸含量，g；

m2——总脂肪酸含量，g。

1.3 数据处理

采用统计分析软件SPSS对数据进行显著性检验。每组试验进行3次，结果用(平均值±标准偏差)表示。

2 结果与分析

2.1 牦牛乳脂肪甘油三酯脂肪酸组成

将提纯的牦牛乳甘油三酯甲酯化，然后进行气相色谱分析，得到总离子色谱图见图1。所得图谱结合37种脂肪酸甲酯标样的保留时间比较分析定性，并采用峰面积归一法定量，结果如表1所示。由表1可得：牦牛乳甘油三酯的脂肪酸种类共12种，中链饱和脂肪酸含量为2.18%～4.22%，饱和脂肪酸总量为63.44%～69.28%，显著高于产自香格里拉地区及西藏拉萨地区的牦牛乳脂肪[1,10]。多不饱和脂肪酸含量为1.01%～2.34%，单不饱和脂肪酸含量为28.40%～34.21%，油酸(24.91%～30.99%)是含量最高的单不饱和脂肪酸。其次为棕榈酸(31.35%～36.48%)和硬脂酸(9.82%～13.87%)。随着海拔的升高，牦牛乳甘油三酯总脂肪酸中的SFA含量呈逐渐降低后升高的趋势，UFA含量呈逐渐升高后降低的趋势。海拔2 500 m处牦牛乳甘油三酯的棕榈酸含量及LA/ALA(油酸/亚油酸)的比值显著高于其他3个样品，硬脂酸显著低于其他3个样品(P<0.05)。海拔3 000 m处牦牛乳甘油三酯的油酸含量显著高于其他3个样品(P<0.05)。

2.2 牦牛乳脂肪Sn-2位脂肪酸组成

利用气相色谱法分析牦牛乳脂肪甘油三酯Sn-2位脂肪酸组成，所得气相色谱见图2。得到牦牛乳脂肪Sn-2位不同脂肪酸含量，结果见表2。结合图2及表2可知：牦牛乳脂肪Sn-2位脂肪酸中含量较高的为棕榈酸(39.91%～46.23%)和油酸(17.42%～20.81%)，十四烷酸(14.66%～20.68%)。不同海拔牦牛乳的Sn-2位棕榈酸的含量之间均有显著性差异(P<0.05)。海拔2 000 m处的Sn-2位棕榈酸含量最高(46.23%)，显著高于其他3个海拔处采集的样品(P<0.05)。此外，青海地区牦牛乳Sn-2位棕榈酸含量(39.91%～46.23%)显著高于普通牛乳Sn-2 位棕榈酸的含量(32.00%～ 34.74%)[11-12]。位于Sn-2位的棕榈酸被体内的胰脂酶水解形成2-甘油一酯，与胆汁盐形成乳糜微粒而被机体吸收，而Sn-1,3位置上的棕榈酸被胰脂酶水解为游离脂肪酸，易与Ca2+形成钙皂，不能被人体很好地吸收利用[13-15]。牦牛乳比普通牛乳更接近母乳中棕榈酸的分布情况，更容易吸收，可为开发相关产品如配方奶粉等提供理论参考[16-17]。海拔2 000 m与海拔3 000 m的牦牛乳样品均未检出位于Sn-2位亚油酸与Sn-2位亚麻酸，而海拔2 500 m与3 500 m 处的牦牛乳样品检出少量。所有牦牛乳脂肪样品的Sn-2位脂肪酸组成中均未检出丁酸，说明丁酸绝大部分结合于Sn-1，3位上。结合2.1节的结果可知，不同海拔的牦牛乳脂肪甘油三酯的总脂肪酸之间及Sn-2位脂肪酸之间大多有显著性差异，初步判断是牦牛在高寒草甸自由放牧，不同海拔之间牧草组成不同，牧草的营养成分影响了牦牛乳脂肪的营养特性。

1.丁酸甲酯 2.己酸甲酯 3.癸酸甲酯 4.月桂酸甲酯 5.十四烷酸甲酯 6.十五烷酸甲酯 7.棕榈酸甲酯 8.棕榈油酸甲酯 9.硬脂酸甲酯 10.油酸甲酯 11.亚油酸甲酯 12.亚麻酸甲酯图1 不同海拔牦牛乳的甘油三酯的脂肪酸组成Figure 1 Different altitude yak milk triglyceride fatty acid composition

表1 不同海拔牦牛乳的甘油三酯的脂肪酸组成及含量†Table 1 Fatty acid composition and content of triglyceride in yak milk at different elevations %

† 同行小写字母不同表明具有显著性差异(P<0.05)；MUFA：单不饱和脂肪酸，PUFA：多不饱和脂肪酸，UFA：不饱和脂肪酸，MCSFA：中链饱和脂肪酸，SFA：饱和脂肪酸。

1.己酸甲酯 2.癸酸甲酯 3.月桂酸甲酯 4.十四烷酸甲酯 5.十五烷酸甲酯 6.棕榈酸甲酯 7.棕榈油酸甲酯 8.硬脂酸甲酯 9.油酸甲酯 10.亚油酸甲酯 11.亚麻酸甲酯
图2 不同海拔牦牛乳脂肪的甘油三酯的Sn-2位脂肪酸组成
Figure 2 Sn-2 fatty acid composition of triglyceride in four kinds of yak milk fat

表2 不同海拔牦牛乳脂肪的甘油三酯的Sn-2位脂肪酸组成及含量Table 2 Sn-2 Fatty acid composition and content of triglyceride in four kinds of yak milk fat %

† “-”表示含量很少或者未检出；同行小写字母不同表明具有显著性差异(P<0.05)。

2.3 不同海拔牦牛乳脂肪酸在甘油三酯结构中的位置分布

如图3所示，结合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的SFA占比达34.1%～40.0%，UFA的占比达21.8%～31.3%。结合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C14:0和C16:0占比分别达到了50.0%～62.5%和37.4%～47.5%，而 C18:0和 C18:1占比达到了16.1%～20.0%和19.6%～28.8%。随着海拔的升高，结合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的SFA占比先逐渐升高，后显著降低(P<0.05)。结合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C18:1、UFA占比呈先逐渐降低，趋于平缓后显著升高的趋势(P<0.05)。结合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C14:0占比先显著性升高，后逐渐降低(P<0.05)。结合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C16:0、C18:0占比均是先显著降低后显著升高再显著降低的趋势(P<0.05)。

小写字母不同表示不同海拔间差异显著(P<0.05)图3 不同海拔牦牛乳脂肪中主要脂肪酸结合在甘油三酯Sn-2位上的占比Figure 3 Proportion of various main fatty acids in yak milk fat at different altitudes in the Sn-2 position of triglyceride

3 结论

青海地区牦牛乳脂肪的脂肪酸种类共12种，其中饱和脂肪酸总量为63.44%～69.28%，含量最高的脂肪酸为棕榈酸(31.35%～36.48%)。Sn-2位脂肪酸种类共检测出9～11种，含量较高的为棕榈酸(39.91%～46.23%)和油酸(17.42%～20.81%)，十四烷酸(14.66%～20.68%)。不同海拔的牦牛乳脂肪甘油三酯的总脂肪酸之间及Sn-2位脂肪酸之间大多有显著性差异。青海地区牦牛乳脂肪中C14：0、C16:0、C15:0、C12：0、SFA主要结合在甘油三酯Sn-2位上，而C18:0、C18:1、C6:0、UFA主要结合在甘油三酯Sn-1,3位上。此外，青海地区牦牛乳Sn-2位棕榈酸含量(39.91%～46.23%)显著高于普通牛乳Sn-2位棕榈酸的含量(32.00%～34.74%)，比普通牛乳更接近母乳中棕榈酸的分布情况，更容易吸收，可为开发相关产品如配方奶粉等提供理论参考。

本研究明确了牦牛乳甘油三酯的Sn-2位脂肪酸组成及其分布情况。并对导致不同海拔Sn-2位脂肪酸组成有显著性差异的原因进行了初步推断——不同海拔生长的牧草不同，其营养成分影响了牦牛乳脂肪的营养特性。目前牦牛乳的营养学研究有待加强，明确了牦牛乳甘三的结构对于研究其营养学特性及牦牛乳制品的开发有促进作用。