银屑病患者外周血Th17、Treg细胞检测及临床意义

丁小洁，王亚琴，刘艳

(1.川北医学院附属医院皮肤科；2.川北医学院附属医院病理科，四川 南充 637000)

银屑病是一种具有特征性皮损的慢性复发性炎症性皮肤病，通常表现为红色丘疹或斑块，上覆厚层银白色鳞屑，刮除银白色鳞屑，可观察到蜡滴现象、薄膜现象、点状出血。因反复发作，导致患者生活质量降低。迄今为止，银屑病的病因及发病机制尚不明确[1-2]。近年的研究[3-4]发现，辅助型T细胞17(Th17)能够通过分泌炎症介质如IL-17、IL-22等来介导炎症反应，被认为是银屑病发病的主要环节之一。调节性T细胞(Treg)是一种具有免疫调节功能的T细胞，能够参与机体的免疫应答与耐受[5-6]。近年来，一些学者认为[7-8]，Treg细胞、Thl7细胞与免疫性疾病的发病、慢性皮肤炎症的进展具有密切的相关性。本课题拟通过对银屑病患者外周血Th17细胞、Treg细胞的表达水平的研究并分析其临床意义，为探寻银屑病治疗的新方法提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取川北医学院附属医院2017年1月至2018年2月门诊患者、住院患者及健康体检者共96 例。其中，银屑病患者34 例，一般慢性皮肤病患者30 例(湿疹14 例、慢性荨麻疹7 例、体癣5 例、大疱性类天疱疮4 例)，健康对照组32 例，所有研究对象均经过医院伦理委员会审查批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采集所有参与对象晨起空腹静脉血5 mL，置于加有EDTA-K2抗凝液的EP管中，冷藏-20 ℃冰箱中备用。主要应用于流式细胞仪检测。

1.2.2 主要试剂与仪器 改良型RPMI1640培养液产自北京赛默飞生物有限公司；胎牛血清产自北京索莱宝科技有限公司；莫能霉素、离子霉素、佛波酯(PMA)来自BD Bioscience；PBS缓冲液为自配。流式细胞仪CANTO型产自美国BD公司，PCR扩增仪ABIABI5700来自美国BD公司。

1.2.3 细胞检测方法 (1) Th17细胞的检测：将新鲜抗凝血样与1640培养基均200 μL混匀，分别加入离子霉素、PMA和莫能霉素，继续培养于37 ℃、5% CO2条件下。荧光素标记单克隆抗体CD3-FITC、CD8-PECy加入到培养后的全血细胞中，在培养箱中避光培养。红细胞经过裂解液处理后，PBS缓冲液冲洗，经过破膜剂及PBS处理后，加入抗人lL-17-PE抗体，室温避光孵育，PBS洗涤后立即上流式细胞仪机检测，整个过程设置阴性对照组；(2)Treg细胞的检测：将新鲜抗凝血样100 μL，加入Tregcooktail试剂20 μL，室温避光孵育，裂解红细胞，PBS洗涤。立即上流式细胞仪机检测，整个过程设置阴性对照组。

1.2.4 血清中炎症因子的检测 采用酶联免疫吸附试验法检测血清中IL-10、IL-17、IL-22和TGF-β的水平，试剂盒均为美国RD公司产品，并严格按照说明书步骤操作。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 3组外周血Th17细胞和Treg细胞检测结果比较

3组患者Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值的方差检验，差异有统计学意义(P<0.05)。通过两组t检验结果分析发现，银屑病患者Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值高于慢性皮肤病患者组及健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组外周血Th17细胞和Treg细胞检测结果比较

*P<0.05，与健康对照组相比；#P<0.05：与慢性皮肤病组相比。

2.2 各组患者血清中IL-10、IL-17、IL-22和TGF-β的水平

银屑病组患者血清中IL-10及TGF-β水平较慢性皮肤病组及健康对照组患者均有下降，差异有统计学意义(P<0.05)。银屑病组患者血清中IL-17、IL-22水平较慢性皮肤病组及健康对照组患者均有升高，差异有统计学意义，P<0.05。见表2。

表2 各组患者血清中IL-10、IL-17、IL-22和TGF-β的水平

*P<0.05，与健康对照组相比，#P<0.05，与慢性皮肤病组相比。

2.3 银屑病患者外周血Th17细胞、Treg细胞与血清中炎症因子的相关性

银屑病患者外周血Th17细胞、Treg细胞水平与IL-10、TGF-β水平呈负相关(P<0.05)；银屑病患者外周血Th17细胞、Treg细胞水平与IL-17、IL-22呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3银屑病患者外周血Th17细胞、Treg细胞与血清中炎症因子的相关性

变量IL-10r值P值IL-17r值P值IL-22r值P值TGF-βr值P值Th17-0.7330.0130.8320.0010.8210.001-0.8660.001Treg-0.8190.0060.8550.0000.8740.000-0.8590.001

3 讨论

银屑病是一种慢性复发性炎症性皮肤病，皮损组织中的大量T淋巴细胞及相关细胞因子形成异常的免疫微环境导致表皮角质形成细胞异常分化[9]。但银屑病的发病机制目前尚不清楚。有学者认为Th17作为一种新型辅助性T细胞，能够分泌IL-17、IL-22等细胞免疫因子，与免疫性疾病及炎症性疾病的发生有着密不可分的关系[10]。本次研究发现，银屑病组患者外周血中Th17细胞表达含量较慢性皮肤病组及健康对照组均有升高，差异有统计学意义(P<0.05)，提示在银屑病患者体内Th17细胞的表达增多。国外有学者[11]发现，Th17细胞在患者的皮损处大量聚集，真皮层含量水平增高，且其mRNA的表达与疾病活动程度相关。也有学者发现，在银屑病患者外周血中IL-17、IL-22的表达含量升高，可能是由于外周血中Th17细胞表达增加，促使血清中IL-17、IL-22等炎症因子的含量增加。本研究也发现，银屑病患者血清中IL-17、IL-22的水平显著高于一般慢性皮肤病患者及健康对照者，且Th17水平与IL-17、IL-22水平呈正相关。另有研究[12]发现，当患者使用依那西普治疗银屑病时，患者血清中IL-17、IL-22的水平明显下降，皮损的严重程度也得到了缓解，提示Th17细胞可能参与银屑病的炎症过程，增加局部病变的炎症反应。

IL-10是一种多细胞源、多功能的细胞因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子，影响单核巨噬细胞主要功能，即释放炎症介质及抗原呈递。TGF-β是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族，对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用，研究发现对于IL-17、IL-22等因子均具有重要的正相关调控作用。Treg细胞属于T细胞亚群，具有免疫抑制功能，能在TCR、IL-2等信号的刺激下活化成为效应T细胞，也能诱导非特异性抑制CD4+、CD8+细胞、自然杀伤细胞等其他免疫细胞的活化和增殖。因此，Treg细胞在体内能够抑制肿瘤免疫、抑制自身免疫性疾病的发生，并能够维持机体内环境的稳态[13-14]。通过Th17与Treg细胞间的动态平衡，保持机体免疫功能的正常运转，打破这一平衡关系，可导致许多免疫相关性疾病及炎症反应[15]。本研究结果显示，在银屑病患者外周血中Treg细胞表达水平显著高于慢性皮肤病组及健康对照组，且Treg的表达水平与IL-17、IL-22水平呈正相关，而Th17/Treg比值较慢性皮肤病组及健康对照组也有升高，说明银屑病患者外周血中Th17与Treg的动态平衡发生了变化，这也可能是激活机体异常免疫反应的其中一环。本文研究还提示，通过监测患者免疫指标的变化，能有效预测或者评估银屑病的病情及治疗效果。

综上所述，银屑病患者外周血中Th17、Treg细胞二者表达水平升高，Th17/Treg比值升高，提示Th17、Treg细胞两者可能参与银屑病的发病，而阻断两者的产生途径可能成为治疗银屑病的新方法。