大鼠卵巢组织体积对其动情周期及体质量的影响

程姣姣 阮祥燕，2* 周 琦 李扬璐 杜 娟 金凤羽 谷牧青 Alfred O. Mueck，2

(1.首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科，北京 100026；2.德国图宾根大学妇产医院妇女健康部与妇女健康研究中心，图宾根 D-72076，德国；3.首都医科大学附属北京妇产医院妇科，北京 100026；4.首都医科大学附属北京妇产医院生殖医学科，北京 100026)

早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)指的是女性40岁之前出现卵巢功能减退，>4个月的停经或月经不调，间隔>4周的连续2次检测卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)>25 IU/L[1-2]。POI的病因复杂[3]，50%的患者特发性病因，即原因不详[4-5]，但也约20%的患者是医源性因素，包括手术和/或性腺毒性治疗，如放射治疗(以下简称放疗)、化学药物治疗(以下简称化疗)、造血干细胞移植等[6]。POI患者生育力大大下降，自然妊娠率约5%[7]，POI患者心血管疾病、骨质疏松症、痴呆等发病率以及各种疾病的早死风险增加[1，5]。

卵巢组织冻存移植(ovarian tissue cryopreservation and transplantion，OTCP)[8-10]是一种新兴的生育力保护方法，是指在患者性腺毒性治疗(放疗、化疗)之前通过腹腔镜手术或者开腹手术取出部分卵巢组织转移到卵巢组织冻存库进行处理、冷冻与冻存，待患者性腺毒性治疗结束至少半年、原发病临床痊愈后将冻存的卵巢组织复苏并移植回患者体内[11]。卵巢组织冻存移植是青春期前女性以及放、化疗无法延迟女性的唯一生育力保护选择[12-14]，卵巢组织冻存移植不仅可以保存患者的生育力，也保存了患者的卵巢内分泌功能[15-16]。在欧洲等发达国家，卵巢组织冻存移植技术已不再是试验性技术，可广泛运用于临床[17-18]。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康的雌性SD大鼠，10周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2011-0012。饲养在环境温度为20～24 ℃、环境湿度为50%～70%的SPF级动物房内，正常日光周期，自由进食及饮水，保持垫料干燥，每3只一笼。该动物实验伦理已通过首都医科大学动物部伦理委员会批准，伦理审批号：AEEI-2018-163。

1.2 动物的实验分组和流程

1.3 大鼠不同卵巢体积切除手术

SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，剂量为40 mg/kg，取俯卧位，剃除其背部两侧毛发，依次用碘伏及75%(体积分数)乙醇对大鼠背部皮肤进行消毒，无菌条件下分别于其左右侧背部卵巢位置平行于脊柱方向剪开皮肤及肌层，各做一约1.5 cm长度的小口，暴露腹腔，找到卵巢脂肪垫，以钝头镊子夹取卵巢脂肪垫，连同卵巢及部分子宫，取出腹腔，采用眼科剪剪去不同体积的卵巢，将子宫及剩余卵巢连同脂肪垫小心回纳入腹腔，分别缝合其肌层及皮肤。

1.4 大鼠动情周期观察

整个观察研究期间，每天早上9至10点进行大鼠阴道脱落细胞涂片，固定大鼠，暴露出阴道，用移液枪吸取50 μL 0.9%(质量分数)氯化钠注射液，小心将移液器枪头插入大鼠阴道0.5～1.0 cm，轻轻吹打3次后吸出，涂片，晾干后备用。在相同的环境下统一进行阴道细胞涂片染色，染色方法采用瑞氏-姬姆萨染液染色法，在自然干燥的涂片上滴加瑞氏-姬姆萨染液2～3滴覆盖整个标本涂片，染1～2 min后，滴加等量pH值为6.4的磷酸盐缓冲液(或等量超纯水)，轻轻晃动玻片，与瑞氏-姬姆萨染液充分混匀，染色3～5 min。水洗、吸干、并通过显微镜(100×)观察。镜下识别出3种类型的细胞：圆形细胞和有核细胞是上皮细胞；没有细胞核的不规则细胞是角质化细胞；小环细胞是白细胞，它们的相互比例用于判断动情周期的不同阶段。动情间期阴道细胞以白细胞为主，动情前期阴道细胞以有核细胞为主，动情期阴道细胞以成片的角化上皮细胞为主，动情后期阴道细胞中白细胞、有核细胞、上皮细胞均可见[20]。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠动情周期不同时期阴道细胞涂片

阴道细胞涂片的典型图片见图1， 图1A涂片可见大量的白细胞，图1B涂片可见大量有核上皮细胞，图1C涂片可见大量成片角化上皮细胞，图1D可见白细胞、有核上皮细胞以及角化上皮细胞。

2.2 切除不同卵巢组织体积对大鼠动情周期的影响

2.3 切除不同卵巢组织体积对大鼠体质量的影响

在卵巢部分切除术后的4、6、8、10、12周，F组(去势组)与其他5组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，F组大鼠的体质量显著高于其他5组，A、B、C、D、E组间差异没有统计学意义(P>0.05)，详见表2，图3。

图1 大鼠动情周期不同时期阴道细胞涂片的典型图片Fig.1 Typical pictures of vaginal cell smears at different periods of estrous cycle in rats (Wright’s-Giemsa staining， 100×)

A: diestrus；B: proestrus；C: estrus；D: metestrus.

表1 各组大鼠动情周期的比较

GroupNumberofcases4Weeks8Weeks12WeeksA124.5±0.774.92±0.665.50±1.05B124.58±0.384.67±0.525.17±0.41C104.42±0.495.67±0.824.67±0.52D124.25±0.504.50±1.006.00±0.00E115.80±0.847.00±2.007.4±0.19F78.50±1.768.67±2.168.67±0.82F17.6678.22712.036P<0.001<0.001<0.001

图2 不同时间不同组大鼠的动情周期Fig.2 Rat of estrous cycle in different groups at different times

GroupNumberofcaseBaseline4Weeks6Weeks8Weeks10Weeks12WeeksA12251.77±6.32287.47±11.40288.54±17.80295.58±15.16302.73±18.01309.46±19.41B12256.78±6.82284.20±12.31287.15±13.83304.23±16.38295.93±19.46304.55±20.97C10258.95±8.36297.98±15.07284.15±16.93292.95±23.83299.95±23.83297.33±25.68D12250.51±6.32270.20±11.40303.07±12.80315.73±15.16326.94±18.01338.83±19.41E11260.20±7.47304.62±13.48292.78±15.14310.26±17.94320.68±21.31336.66±22.97F7252.60±6.32336.96±11.40356.61±12.80377.59±15.16387.46±18.01402.00±19.41F0.333.9864.2263.9423.3883.590P0.8910.0070.0050.0070.0150.012

图3 不同时间不同组大鼠的体质量Fig.3 Rat of weight in different groups at different times

*P<0.05vsGroup A，Group B，Group C，Group D，Group E.

3 讨论

3.1 保留不同卵巢组织体积对动情周期的影响

放射治疗联合化学药物治疗(以下简称放化疗)卵巢组织的损伤以及发生POI的可能性与放疗和/或化疗类型、剂量、患者的年龄、本身的卵巢储备功能都有关系[21]，卵巢组织冻存患者的年龄一般不超过35岁[12，22]，如果患者的卵巢功能好，可适当放宽年龄限制。一旦年轻女性患者确诊为癌症，放化疗方案确定后，发生POI的可能较高时，可考虑增加卵巢组织冻存量[18]，或者如果患者情况允许，可配合其他的生育力保护方案，如卵子冻存、胚胎冻存等[23-24]。截止到2017年7月，全球已有超过132名通过卵巢组织冻存移植技术诞生的婴儿[17]，截止到目前，已有超过154名婴儿，卵巢组织移植后超过95%的患者恢复了卵巢正常的内分泌功能[25-26]，Van der Ven等[27]报道了FertiPROTEKT生殖力保护网络更新了最新的汇总数据，在卵巢组织冻存时年龄<35岁的女性中，卵巢组织移植后的妊娠率为33%，在超过35岁的女性中，妊娠率为18%[28]。Meirow等[29]报道了卵巢组织移植后妊娠率为53%，活产率为32%。这些充分说明了卵巢组织冻存移植技术的成熟与可靠，欧洲等发达国家已将此技术设定为临床常规[22，30-31]。

3.2 保留不同卵巢组织体积对体质量的影响

本研究设定6个时间点监测大鼠的体质量，本研究中切除双侧的卵巢组织大鼠的体质量明显高于其余5组的大鼠。雌性大鼠去势后将不再分泌雌孕激素，但雌激素对机体脂肪分布和脂肪细胞分化有重要影响，雌激素和雌激素受体调节葡萄糖和脂质代谢的各个方面，雌激素缺乏会使得腹部脂肪堆积，育龄期妇女和更年期妇女的体质量和腹部脂肪分布不同，并且绝经女性体质量增加、超重及肥胖是公共卫生问题。40～59岁女性肥胖的发生率约65%，超过60岁的女性肥胖的发生率约73.8%[32]，但绝经女性肥胖发生率增加的原因尚不清楚。

3.3 局限性和不足

本研究的设计存在不足之处，未定期采血检测SD大鼠血清中卵巢激素浓度或其他指标以充分补充或证实本研究结论。本实验只观察了3个月，只能得出观察的3个月时间内每组大鼠动情周期和体质量的变化。