超高效液相串联四级杆-飞行时间质谱快速测定食品原料中的氯化血红素

李伟丽，伍姚，刘玉淑，喻卉，任艳娇，周文化，吴韬*

1(西华大学 食品与生物工程学院，食品生物技术重点实验室，四川 成都，610039)2(中南林业科技大学 特医食品加工湖南省重点实验室，湖南 长沙，410004)

血红素是由二价铁离子镶嵌在原卟啉中而构成的铁卟啉类化合物，可作为血红蛋白、肌红蛋白等的辅基成分，主要存在于动物的血液和肌肉中，具有改善贫血、降低肺动脉高压等作用，在保健食品、医药等行业具有广泛的应用[1-3]。氯化血红素(又名血晶素、氯化高铁血红素)是一种由4个吡咯环组成的，含有共轭结构的生物铁化合物[4-5]。研究发现，氯化血红素是一种吸收效果好、无毒副作用的缺铁性贫血的食品原料及色素添加剂，也可作为过氧化物模拟酶、生物态铁剂等，具有广阔的应用前景[6-9]。

氯化血红素的检测方法已有较多报道，包括紫外分光光度法[10]、高效液相色谱法[11]和流动注射化学发光法[12]等。其中，紫外分光光度法、高效液相色谱法是在特定波长下利用氯化血红素紫外吸收能力进行的定量分析，如果样品中存在不易分离的杂质干扰，可能会影响测定结果的准确性。流动注射化学发光法灵敏度不高，分析时间较长，无法适用于食品中更精确、更微量的分析。超高效液相串联四级杆-飞行时间质谱(UHPLC-QTOF-MS)同时具有高效的色谱分离和m/z高分辨率的优点，可以同时对食品等复杂体系中的目标成分进行快速地定性、定量分析[13-17]。目前尚未见到利用UHPLC-QTOF-MS测定氯化血红素的含量研究。本文拟研究建立UHPLC-QTOF-MS方法进行氯化血红素的定性定量分析，根据氯化血红素的精确分子量和二级碎片离子进行准确定量，排除了其他杂质的干扰，能够为氯化血红素的测定提供有效理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪，日本岛津仪器有限公司；X500飞行时间质谱，上海爱博才思分析仪器有限公司；BT-25S分析天平，成都世纪方舟科技有限公司；SB-5200DTN超声清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

NaOH(分析纯)、氯化血红素标品，上海化成工业发展有限公司；氯化血红素保健品样品(编号为1、2、3、4号)，四川某制药有限公司；甲醇(色谱纯)，Sigma公司，实验用水均是超纯水。

1.2 方法

1.2.1 色谱分析条件

色谱柱：采用C18柱(1.8 μm粒径，2.0 mm i.d×75 mm)；流动相：A相，纯甲醇溶液；B相，0.02%甲酸-水溶液(体积分数)；流速：0.25 mL/min；进样量：2 μL，色谱柱温度：40℃；采用梯度洗脱，流速保持不变，初始B相为80%，0～2 min，B相60%；2～4 min，B相50%；4～6 min，A相100%，保持2 min；8～9 min，B相80%，保持1 min。

1.2.2 质谱分析条件

离子源：ESI离子源；扫描方式：MRM正离子模式。质谱分析条件：气帘气(CUR)35psi，离子化压力(IS)5500 V，温度(TEM)300℃，喷雾气(GS1)45 psi，辅助加热气(GS2)55 psi，去簇电压(DP)80 V，碰撞能量(CE)15 V，扫描范围m/z100～1 000。

1.2.3 前处理方法

氯化血红素标准品准备：称取0.1 mg氯化血红素标品溶解于1.0 mL 0.10 mol/L NaOH溶液，将标品原液贮存于-18 ℃备用。用甲醇将标品原液分别稀释成质量浓度2.5、12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L。

食品原料样品准备：分别称取50.0 mg样品溶解在1.0 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，超声提取15 min后，过0.22 μm有机滤膜，吸取滤液1.0 mL，用甲醇稀释100倍。将稀释液贮存于-18 ℃备用。

1.2.4 方法验证

通过测量加标回收率、基质效应、检出限(limit of detection, LOD)[18]、定量限(limit of quantity, LOQ)、日内精密度来验证方法的可靠性。本实验选择具有较高氯化血红素含量的3号样品进行方法验证。采用标准添加法测定氯化血红素LOD和LOQ，以定量离子信噪比(S/N)3倍所对应目标物的浓度作为LOD，S/N的10倍作为LOQ。通过分析25、50和100 mg/mL 3种加标浓度来确定加标回收率，样品与加标量的体积比为1∶1，并用公式(1)计算加标回收率[19]。

(1)

式中：Csm是加标测量值;Cm是样品的测量值;Cs是加标前标准品的浓度。

通过用样品溶液溶解并稀释标品来制备基质效应的标准曲线，校准曲线2.50～100.00 mg/L。基质效应通过公式(2)计算[20-22]。

(2)

式中：a是基质校准曲线的斜率;b是溶剂校准曲线的斜率。

2 结果与分析

2.1 氯化血红素标准品的定性研究

从氯化血红素标准品溶液的一级质谱图看出(图1-A)，一级质谱的最强离子峰为m/z616，没有发现分子离子峰m/z651。其可能原因在于氯化血红素中氯原子的共价键能力较弱，容易在ESI离子化过程中失去，因此选定m/z616 进行二级碎裂。如图1-B所示，二级离子碎片主要为557.160 2和498.148 1。氯化血红素分子离子的断裂特点为母环不发生碎裂，只在侧基CH2CH2COOH发生中性丢失反应。当血红素分子离子丢失1个CH2COOH时，得到m/z557的碎片离子，而丢失2个CH2COOH时则得到m/z498的碎片离子。为了降低氯化血红素铁的检出限，选择信号最强的离子对(616.173 2→557.160 2)，采用多反应监测模式(MRM)作对氯化血红素进行定量分析。氯化血红素标准品在MRM扫描模式下的色谱图见图1-C，经过色谱优化以后，在6.5 min左右实现分离且峰型良好。

图1 氯化血红素标准品氯化血红素标品一级质谱图(A)，氯化血红素标品二级质谱图(B)，氯化血红素标品色谱图(C)Fig.1 Figures of hemin standard mass spectrum of hemin standard(A), MS/MS spectrum of hemin standard(B),chromat-ogram of hemin standard(C)

2.2 血红素保健品中氯化血红素定性定量分析

图2-A是1号保健品的一级质谱图，其最强峰为m/z616。对m/z616进行二级碎裂，其二级质谱图(图2-B)和氯化血红素标准品二级质谱完全一致，因此确定血红素保健品含有氯化血红素。在MRM扫描模式下的提取的色谱图如图2-C所示，该样品峰型较好。其可能原因是采用MRM检测模式，排除了杂质干扰。

图2 氯化血红素样品图(1号样品)氯化血红素样品一级质谱图(A)，氯化血红素样品二级质谱图(B)，氯化血红素样品色谱图(C)Fig.2 Hemin sample (sample No. 1) mass spectrum of hemin sample(A), MS/MS spectrum of hemin sample(B),chroma-togram of hemin sample(C)

按照本实验所建立的方法，对4份样品中的氯化血红素进行定性定量分析，检测结果见表1。由表1可知，在4种样品中均检测出氯化血红素，其中4号样品的氯化血红素含量最高为7.40%，2号样品的含量最低为1.16%，1、3号样品的含量分别为1.40%、7.32%。

表1 样品中氯化血红素的含量分析(n=3)Table 1 Analysis of the content of hemin in the sample

2.3 方法的线性范围，检出限、定量限和精密度

在设定的UHPLC-QTOF-MS条件下，将氯化血红素的质量浓度(mg/L)作为横坐标x，氯化血红素的峰面积作为纵坐标y进行线性回归，确定回归方程为y=130 110.294 2x+1 402 020，其相关系数(R2)为0.957，线性2.50～100.0 mg/L。由表2可知，氯化血红素的检出限和定量限分别为1.25 μg/L和4.00 μg/L，与高效液相色谱法测得检出限和定量限分别为0.11 mg/L和0.37 mg/L相比[23]，UHPLC-QTOF-MS方法的检出限和定量限分别降低了88倍和92倍。这表明UHPLC-QTOF-MS方法对于测定氯化血红素具有更高的灵敏度。根据SANTE/ 11945/2015欧盟指南[24]，≤20%表明取得较好的精密度。实验测得RSD为3.84%，表明该方法具有较好的精密度，能够准确可靠的对氯化血红素进行定量分析。

2.4 样品加标回收试验

为了验证方法的准确性，本研究选取3号样品进行加标回收试验。分别向3号样品中分别加入25、50、100 mg/L不同质量浓度的氯化血红素标准品，混匀，测定其回收率。每个加标样品重复测定6次，其结果见表3。

表2 线性范围、相关系数、回归方程、检出限、定量限和精密度Table 2 Linear regression equations, correlation coefficient, LOD, LOQ and precision

表3 加标回收率(n=6)Table 3 Spiked recoveries rate(n=6)

由表3可知，3号样品分别添加3个不同浓度标准品测得的回收率分别为80.65%、91.06%、102.99%，这表明该实验方法具有较高的回收率。

2.5 基质效应

基质效应通常表明样品其他成分对被测组分的影响。基质在电离过程中会对目标物的电离产生增强或者抑制作用，这可能会对复杂样品的定量分析产生不利影响。根据研究表明[25]，|基质效应|≥50%被认为具有强的基质效应。由表4可知，氯化血红素的基质效应<50%，表明基质对氯化血红素的定量分析影响相对较弱。

表4 基质效应与校准曲线Table 4 Matrix effect and calibration curve

3 结论

本文首次建立了UHPLC-QTOF-MS快速测定氯化血红素的分析方法，该方法通过目标物分子量和二级碎片离子进行定量分析。在ESI+电离模式的条件下，氯化血红素在6.5 min左右达到最佳分离效果，检测限和定量限分别为1.25 μg/L和4.00 μg/L，回收率范围为80.65%～102.99%，精密度为3.84%。此方法的优势在于样品前处理简单，能够有效为保健品中氯化血红素的定性定量测定提供理论依据。