25种中草药提取物对棉花黄萎病菌的抑制作用

金利容 尹海辰 万鹏 黄薇 许冬 杨妮娜

摘要以棉花黄萎病菌Verticillium dahliae为供试菌种，采用菌丝生长速率法测定了25种中草药乙醇提取物的抑茵作用。结果表明，25种中草药乙醇提取物中，花椒、黄柏和木香的抑菌作用最好，抑制率分别为59.30%、48.29%和45.54%。同时，这3种中草药的乙醇提取物抑菌活性均显著高于石油醚提取物的抑茵活性。在室内毒力测定中，花椒、黄柏和木香的乙醇提取物对供试菌株的EG50分别为3.74，13.98和17.02mg/mL。

关键词中草药提取物;棉花;棉花黄萎病菌;抑制作用

中图分类号：S435.621.2文献标识码：B DOI：10.16688/j.zwbh.2018153

棉花是重要的经济作物，棉花黄萎病是棉花上的主要病害，严重影响棉花的品质和产量。棉花黄萎病是一种土传病害，其病原菌具有广泛的寄主，可产生具有强抗逆性的微菌核休眠结构，能够定殖在植物的根部和维管束内，这些特点导致传统的杀菌剂对其并不能产生好的防治效果。抗病品种的选育是防治棉花黄萎病的重要方法，但是，品种抗性的不稳定是抗病育种的一大阻力。因此，黄萎病的防治一直是作物病害防治和农业生产中的一大难题。

利用植物产生的活性物质防治病害是植物病害防治的一个重要方面。植物是天然活性化合物的重要来源，具有非常丰富的次生代谢物质。目前科研工作者已经从植物中提取到多类抗真菌的活性物质。与微生物杀菌剂相比，植物杀菌剂具有稳定，不太容易受到环境要素影响，对人畜安全，低毒低污染等优势。在我国，中草药在医学领域的应用有悠久的历史。中草药资源丰富，种类达1万多种，是植物源杀菌剂的重要来源。

采用中草药提取物抑制各种常见植物病害的研究已有一些文献报道，比如玉米大斑病、番茄枯萎病、辣椒根腐病、黄瓜白粉病等，但未见中草药提取物抑制棉花黄萎病菌的研究报道。笔者采用菌丝生长速率法测定了25种中草药的乙醇提取物对棉花黄萎病菌的抑菌作用，在此基础上选取抑菌活性最好的3种中草药的乙醇提取物进行了毒力测定，并比较了这3种中草药的乙醇提取物和石油醚提取物的抑菌活性。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1供试菌种

棉花黄萎病菌V991b为一株典型的大丽轮枝菌Verticillium dahliae菌株，由本实验室-80℃保存。

1.1.2供试中草药

25种供试中草药原料从湖北省武汉市中药材市场采购，具体信息见表1。

1.2方法

1.2.1供试中草药粗提取物的制备

粗提物的提取采用有机溶剂（乙醇和石油醚）提取法。将风干的中药用粉碎机磨制成干粉，称取100g粉末分别置于250mL无水乙醇（或石油醚）中室温浸泡15d后用布氏漏斗过滤。用旋转蒸发儀45℃左右水浴蒸干溶剂，获得粗提物，并保存于4C冰箱中备用。

1.2.2供试中草药乙醇提取物的抑菌作用

采用生长速率法测定中草药乙醇提取物对棉花黄萎病菌生长的抑制作用。将供试中草药提取物称重，先用200uL无水乙醇将其完全溶解，再加入无菌水使溶液的终浓度为10mg/mL，与冷却至50℃左右的PDA培养基以体积比1：9的比例混匀后倒人培养皿中直至凝固，每处理3次重复，以无菌水和PDA培养基按同样比例混匀作为对照。活化菌株V991b，用6mm的打孔器沿着菌种同一个圆周打孔，用接种针小心将供试菌种接到含药培养基的正中央，菌丝面朝下，每皿一块。于25℃恒温培养箱中培养7d。用十字交叉法测量菌落直径，取平均值，计算抑菌率。

抑菌率一（对照菌落直径一处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。

1.2.3

供试中草药乙醇提取物的室内毒力测定

根据“1.2.2”的结果，选择抑菌率在45%以上的中草药，设置2.5、5、10、20和40mg/mL 5个浓度梯度，按照“1.2.2”的试验方法，测定不同浓度的中草药乙醇提取物的抑菌作用，计算抑菌率。

1.2.4供试中草药乙醇提取物和石油醚提取物的抑制作用比较

按照“1.2.2”中所述的试验方法，统一将提取物配制成10mg/mL，分别测定抑菌效果好的3种供试中草药的乙醇提取物和石油醚提取物的抑菌率，比较两者的抑制活性。

1.2.5数据处理及分析

采用Excel软件和SPSS软件处理相关数据，将各中草药乙醇提取物的抑菌率转换成几率值（y），药剂浓度转换成对数值（x），采用回归法求得不同提取物对供试菌株的毒力回归方程y=ax+b，并计算毒力回归方程相关系数r和抑制中浓度EG50。

2结果与分析

2.1供试中草药乙醇提取物对棉花黄萎病菌的抑制作用

各中草药乙醇提取物对棉花黄萎病菌的抑制作用结果见表2。由表2可知，25种中草药乙醇提取物（测试浓度为10mg/mL）对棉花黄萎病菌均有不同程度的抑制作用。抑制作用最好的是花椒乙醇提取物，抑菌率为59.30%;抑菌率在45%以上的还有黄柏和木香的乙醇提取物。抑菌率在30%～45%的有蛇床子和苦参。选择花椒、黄柏和木香进行后续试验。

2.2供试中草药乙醇提取物的室内毒力测定

花椒、黄柏和木香的乙醇提取物对棉花黄萎病菌的抑制活性最好，抑制率均在45%以上。对这3种中药的乙醇提取物进行了室内毒力测定，结果表明，当这3种中草药的乙醇提取物的浓度在2.5～40mg/mL范围内时，随着提取物浓度的增加，3种中草药的乙醇提取物对黄萎病菌的抑菌能力有所增强（表3）。

对表3中的数据进行分析表明，提取物的浓度和抑制率之问存在明显的线性关系，花椒、黄柏和木香的乙醇提取物对供试菌株的EC5。分别为3.74mg/mL、13.98mg/mL和17.02mg/mL。相关系数分别为0.94、0.96和0.98。结果见表4。

2.3供试中草药乙醇提取物和石油醚提取物的抑制作用比较

测定和比较花椒、黄柏和木香的乙醇提取物和石油醚提取物对黄萎病菌的抑制作用，结果表明，3种中草药的乙醇提取物的抑菌活性都显著高于石油醚提取物的抑菌活性（P<0.05）。在这3种中草药的乙醇提取物中，花椒的抑菌作用最好。但在石油醚提取物中，木香的抑菌作用最好，结果见表5。

3讨论

引起棉花黄萎病的病原菌为大丽轮枝菌。该研究以大丽轮枝菌V991b为供试菌株，选取25种中草药提取物对大丽轮枝菌V991b进行室内抑菌试验。结果表明，25种中草药提取物对大丽轮枝菌均有一定的抑制作用，其中花椒、黄柏和木香的乙醇提取物（药剂浓度为10mg/mL）的抑菌率均在45%以上，且抑菌活性随着药剂浓度的升高而增强。花椒的乙醇提取物抑菌效果最好，抑菌率在50%以上。花椒能够产生挥发性物质，可能在抑制病原菌生长过程中发挥一定的作用。马欣等报道黄柏的乙醇提取物对番茄枯萎病菌和辣椒根腐病菌的抑菌率能够达到90%和60%以上。黄柏能够产生黄酮醇甙，对某些人类病原菌如金黄色葡萄球菌等具有抑制作用，但该物质在抑制植物病原菌的过程中是否有作用，需要进一步验证。本研究还比较了3种中草药的乙醇提取物和石油醚提取物的抑菌活性，结果表明乙醇提取物的抑菌作用要显著高于石油醚提取物的抑菌作用，其原因尚不明确。

很多研究表明一些中草药对植物病原菌有一定的抑菌作用，抑菌机理主要是中草药的有效成分通过破坏病原菌细胞膜和细胞壁或者干扰病原菌的代谢作用达到抑菌的目的。下一步的研究工作包括：对花椒、黄柏和木香等的有效抑菌活性成分的分离和鉴定;活性成分对大丽轮枝菌抑菌机制研究;田问药效测定等。筛选对植物病原菌有效的中草药药剂并研究其作用机制，将会为植物源农药的研制和开发提供新途径和新思路。