黑曲霉超临界萃取物抑制链格孢作用机制的初步研究

张素 袁洪威 李祝 肖洋 吉玉玉 唐婧红

摘要本试验对黑曲霉菌丝体超临界萃取物（SE）抑制链格孢的机制进行了初步研究。采用超临界萃取从黑曲霉菌丝体中获得样品SE，使用气相色谱质谱（GC-MS）对其萃取物进行分离鉴定，并通过细胞膜渗透性测定、核酸和总蛋白含量测定、4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染色法、活性氧（ROS）含量测定、呼吸代谢途径等方法对SE的抑菌机制进行研究;电导率及核酸、蛋白结果显示，SE能影响链格孢细胞膜的完整性，SE处理茵体4.5h，电导率比阴性对照增加了37.2%，胞外核酸蛋白含量显著增加。DAPI染色结果显示，DAPI可以和链格孢内的核酸结合，经SE作用30min，SE可引起细胞核染色质异常弥散。ROS试验结果显示，SE可以激发菌体产生过多的活性氧，SE作用链格孢40min时ROS含量比阴性对照增加了79.67%。呼吸代谢试验结果显示，SE能抑制三羧酸循环（TCA）中的琥珀酸脱氢酶的活性，其抑制率为35.4%。SE具有较强的抑菌活性，其抑菌机制是通过影响细胞膜的正常功能、损伤细胞结构和抑制真菌的呼吸代谢等方面实现的。

关键词黑曲霉;超临界萃取;链格孢;抑菌机制;琥珀酸脱氢酶;DAPI

中图分类号：S482.292文献标识码：A DoI：10.16688/j.zwbh.2018193

2.3SE对菌体细胞膜的影响

培养液电导率的改变可以反映细胞膜渗透性的改变。本研究的测定结果显示，SE作用菌体初期，上清液电导率随时问的增加而增大。当作用4.5h时，SE组电导率达到峰值，比阴性对照增加了37.2%（P<0.05）（图3），说明SE能影响链格孢细胞膜的通透性。有文献报道可测定加药前后DNA和RNA等大分子物质的变化推测药物对细胞膜完整性的影响。为考虑SE影响链格孢细胞膜的通透性程度，测定了SE作用后菌体大分子物质泄漏情况。如图4所示，SE作用菌体初期核酸和蛋白质含量明显高于阴性对照组，虽然随时问推移呈逐渐下降趋势，但差异依旧显著（P<0.05）。以上两个试验说明，SE不仅引起链格孢细胞膜渗透性的改变，还可导致核酸和蛋白等大分子物质外漏。

2.4SE对链格孢核酸含量的影响

DAPI是一种能够与DNA和RNA结合的荧光染料，核酸量越大，荧光亮度越强。通过倒置荧光显微镜（OLYMPUS IX73）观察，DAPI可以穿透细胞膜进入细胞内部，与核酸相结合。阴性对照与SE处理链格孢30min内的荧光显微镜观察结果见图5。与阴性对照相比SE处理链格孢后该细胞核染色质出现异常弥散，推测可能是SE导致的急性细胞核破碎，随时问推移，细胞核损伤程度逐渐降低。

2.5SE对链格孢活性氧含量的影响

胞内ROS过度积累，会对膜脂、蛋白质、核酸等产生氧化损伤，进而触发或者加速细胞凋亡进程。Image J荧光定量分析结果（图6）显示：SE可以激发链格孢菌体产生过多的活性氧，SE组胞质中ROS含量呈先升后降趋势，在处理40min时出现峰值，与阴性对照相比差异极显著（P<0.01）。SE处理会导致链格孢菌体内大量的ROS产生，从而影响细胞的正常代谢过程。

2.6SE对菌体三羧酸循环关键酶的影响

琥珀酸脱氢酶（SDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）是真核细胞和原核细胞进行TCA循环途径中的关键酶，在细胞能量代谢中起着重要的作用，其活性变化可反映细胞的能量代谢状况。图7a为采用Bradford法制作的标准曲线，回归方程y=1.3771x+0.1356，相關系数R²=0.9956，具有良好线性关系，满足样品测试要求。SE对链格孢的SDH酶具有明显的抑制作用。SE组SDH比活性与阴性对照相比降低了35.4%。SE组MDH比活性与阴性对照相比虽呈下降趋势，但未有显著差异（P>0.05）;由上可知，SE处理后会导致正常的三羧酸循环过程受阻，影响细胞的正常代谢。

3讨论

近年来随着绿色化学的兴起，研究者们已经从生物中发现大量有活性的天然产物，很大程度地丰富了化学资源。真菌化学成分种类丰富，包括甾醇、萜、生物碱、氨基酸、肽类、多糖等，已成为探索和发掘新化合物的重要领域。超临界萃取是一种高效的提取技术，目前已广泛应用于天然产物的分离提取过程。本文通过超临界萃取从黑曲霉菌丝体中提取得到萃取物SE。经GC-MS分析出5种已知化合物，含量最高的两种物质为5-羟甲基糠醛（90.194%）和5，5-（氧二亚甲基）-双-2-呋喃甲醛（7.843%）。有文献报道5一羟甲基糠醛具有一定的医药价值，糠醛可用于农药合成，因此推测黑曲霉超临界萃取物SE可能具有生物活性，本文对SE的抑菌机制进行了研究。

研究结果显示，SE对链格孢具有明显的抑菌活性。通过对培养液、胞外核酸和蛋白质等大分子物质的测定结果表明，SE不仅引起链格孢细胞膜渗透性的改变，还破坏了细胞膜的完整性，导致胞内核酸、蛋白质等大分子物质的泄漏。其作用效果与刘海燕等用细辛挥发油处理土生链格孢后结果相一致，SE处理导致链格孢的细胞膜完整性受到破坏。DAPI是一种能够与DNA和RNA结合的荧光染料，核酸含量越高，荧光亮度也就越强。AL-LENE253研究表明糠醛能导致核染色质异常，造成细胞核损伤。DAPI染色结果显示经SE作用后链格孢与阴性对照相比细胞核染色质出现异常弥散，推测可能是SE导致急性的细胞核破碎化，而且随时问推移，细胞核损伤程度降低。活性氧（reactive OX-ygen species，ROS）是一类分子氧部分还原的分子或离子，具有很强的氧化活性，过量的ROS能够使生物大分子如DNA、蛋白质、脂类发生过氧化链式反应，造成细胞结构的损伤，影响生理活性。SE可以激发菌体中产生过多的活性氧，SE作用链格孢40min时ROS含量比阴性对照增加了79.67%，试验结果与ALLEN等所描述糠醛导致胞内活性氧积累，从而损伤细胞结构一致。呼吸代谢是生物体进行生命活动的重要表现形式，其实质是细胞内糖的氧化代谢过程，一旦糖的氧化代谢被抑制，供给细胞生命活动所需的能量和合成代谢所需要的碳架及还原力就无法生成，使生物体的生长和繁殖受阻。琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的关键酶，对细胞生长代谢和繁殖是必需的。本研究结果显示，SE对链格孢SDH的活性具有明显的抑制作用，SE作用链格孢SDH酶的比活性比阴性对照降低了35.4%，这与SE会抑制参与TCA循环和糖酵解的相关酶活论证相一致。推测其原因可能是SE与SDH相结合，导致酶的分子结构发生了变化，使酶的活性降低，从而导致菌体ATP和NADH的合成受阻，最终抑制其呼吸代谢系统。

综上所述，SE通过影响细胞膜的正常功能、损伤细胞结构和抑制真菌的呼吸代谢等方面抑制链格孢的生长，其抑菌活性可能与萃取物中的活性物质相关。本试验中得到的萃取物是多种化学成分的混合物，抑菌活性是一种主要成分的作用，还是多种化学成分协同作用，它们的反应机制等问题目前还未知，要解决这些问题还有待于进一步的科学研究。本文通过试验明确了黑曲霉超临界萃取物主要成分的含量，并对其抑制链格孢的机制进行了初探，为黑曲霉真菌资源和微生物农药的进一步开发应用提供了理论基础和依据。