谷子膜结合脂肪酸脱氢酶基因家族的鉴定及进化分析

李 凤，郑汪东，唐文博

（山西大同大学生命科学学院，山西大同大学设施农业技术研发中心，山西大同037000）

谷子（Setaria italica）古称粟，脱壳后即为小米，是禾本科黍族狗尾草属1年生草本植物，为我国起源的特色作物。小米以其独特的风味和丰富的营养价值成为广大人民群众喜爱的杂粮。我国是世界上谷子栽培面积最大的国家，在我国，谷子种植主要分布在北方各省的干旱、半干旱地区。谷子性喜高温，生育适温介于22～30℃，属于抗逆稳产作物，在植物抗逆机理研究方面具有独特价值[1]。

干旱、盐害及冷害等胁迫严重影响着我国北方作物的产量和品质。谷子经过长期的自然选择及不断进化，形成了完善的抗逆机制，成为挖掘抗逆基因的优异种质资源。近年来，人们对谷子的抗逆机制研究已取得了一定进展，特别是谷子测序工作的完成，为谷子中抗逆基因的筛选和鉴定提供了可能，谷子也迅速发展成为功能基因组研究中新的候选模式作物[1]。通过从谷子自身分离挖掘抗逆基因，对农作物进行抗逆分子育种，可以改良作物种质资源。到目前为止，已有不少研究对谷子中的抗逆相关基因进行了鉴定及功能研究[2-3]。

作为植物细胞膜脂的主要组成成分，不饱和脂肪酸能够维持细胞结构和细胞膜的正常流动，同时，不饱和脂肪酸参与着植物的生长发育过程以及应答多种环境信号[4]。脂肪酸脱氢酶（fatty acid desaturases，FAD）是一类不饱和脂肪酸合成途径的关键酶，能够催化脂肪酸链的特定位置上脱氢形成双键，产生不饱和脂肪酸[4]。根据酶的定位和辅因子需求不同，FAD分为可溶性FAD和膜结合FAD两大类。其中，膜结合FAD存在于内质网膜和质体膜上，能够催化以结合脂形式存在的脂肪酸进行脱氢反应。该类酶在生物体中普遍存在，编码该类酶的基因是一个高度多样化的基因家族[5]。

已有不少研究表明，膜结合FAD基因能够维持植株在逆境胁迫条件下的正常生长。水稻Os－FAD8、大豆FAD3及FAD7能强烈响应低温胁迫的诱导[6-7]。拟南芥FAD2和FAD6与番茄LeFAD3的表达均能显著提高幼苗的耐盐性[8-9]。在转基因烟草中，FAD7基因的超表达显著提高了植株的抗寒性[10]。将高山离子芥中克隆出的FAD3基因转到烟草中过表达，能明显提高烟草抵抗冷害、干旱和盐害的能力[11]。目前，膜结合脂肪酸脱氢酶已在多种植物例如拟南芥、大豆、水稻、棉花等进行了鉴定及进化分析，但在谷子上的研究尚未见报道。

本研究在谷子基因组测序完成的基础上，首次对谷子膜结合FAD基因家族成员在全基因组水平上进行鉴定及进化分析，旨在为今后研究谷子膜结合FAD的功能及抗逆机制提供重要的理论依据，为农作物抗逆育种提供一系列候选基因。

1 材料和方法

1.1 谷子膜结合FAD基因的检索

从TAIR数据库[12]中下载拟南芥FAD的氨基酸序列[13]；从Phytozome数据库[14]中下载谷子的基因组序列[1]，以拟南芥膜结合FAD基因的蛋白序列作为探针（query），利用Blast P程序搜索谷子的基因组数据库，之后用Pfam[15]和SMART[16]数据库对候选基因进行验证，筛选后的基因作为最终的膜结合FAD成员进行后续研究。

1.2 谷子膜结合FAD基因家族的进化分析

利用Clustal X软件[17]对拟南芥、水稻及谷子中所有的膜结合FAD成员进行氨基酸序列联配。利用Mega 7软件[18]，采用邻接法构建进化树。利用GSDS工具[19]对FAD基因成员的基因结构进行分析，蛋白质的分子量和等电点利用ProtParam软件[20]进行预测。

1.3 谷子膜结合FAD成员的染色体定位和基因复制分析

谷子中膜结合FAD成员的染色体位置信息从谷子基因组数据库中获得，染色体分布图采用MapInspect软件进行绘制。复制基因的判定方法依据前人的研究[21]，根据复制基因在染色体上的分布位置将其区分为串联重复事件和片段重复事件。

2 结果与分析

2.1 谷子膜结合FAD基因的鉴定与注释

本研究通过Blast P程序最终在谷子基因组中鉴定出9个膜结合FAD基因家族成员，并按照拟南芥和水稻中同源基因的名称对所鉴定的谷子膜结合FAD基因进行命名（表1）。通过对谷子膜结合FAD编码的蛋白质信息进行分析可知，SiSLD2的氨基酸序列最长，数目达到470个，而SiDSD1的氨基酸序列最短，数目仅有325个；预测的分子量最高是 51.96 ku（SiSLD2），最低是 37.46 ku（SiDSD1）；等电点分布在 7.94（SiDSD1）～9.55（SiFAD2.2）。

表1 谷子膜结合FAD基因家族编码的蛋白质信息

2.2 谷子膜结合FAD基因家族的进化分析

本研究用Mega 7软件构建拟南芥、水稻和谷子膜结合FAD的系统进化树，根据前人研究将其划分为4个不同的功能亚家族，分别为第一类脱氢酶（First）、鞘脂类脱氢酶（Sphingolipid）、Front-end脱氢酶（Front-end）和 ω 类脱氢酶（Omega）（图 1），用于阐明膜结合FAD基因之间的系统进化关系。

第一类脱氢酶亚家族包括ADS基因编码的Δ7脱氢酶和Δ9脱氢酶，这类脱氢酶的作用是在饱和酰基链上引入第一个C＝C双键[5]。在拟南芥中共鉴定出9个膜结合FAD基因属于该亚家族，而在谷子和水稻中均未鉴定出属于该亚家族的成员。

Front-end脱氢酶也称羧基定向脱氢酶，包括SLD基因编码的Δ8脱氢酶，该类脱氢酶能在已有的双键和脂肪酸链羧基末端间形成双键[5]。谷子膜结合FAD基因中有2个SLD成员属于该亚家族，拟南芥中也有2个SLD，水稻中只有1个。

鞘脂类脱氢酶亚家族包含一类DSD基因编码的Δ4脱氢酶[5]。在谷子、拟南芥和水稻中均只鉴定出1个DSD基因。

Omega类脱氢酶亚家族编码Δ12脱氢酶和Δ15脱氢酶，它们是一类甲基定向脱氢酶，催化在已有双键和脂肪酸链甲基末端之间形成双键[22]。其中，Δ12脱氢酶由FAD2和FAD6基因编码，Δ15脱氢酶由FAD3、FAD7和FAD8基因编码。从所构建的进化树可以看出（图1），FAD2和FAD6基因处于不同的进化分支上；在谷子、拟南芥和水稻中均仅鉴定出1个FAD6，而FAD2数目不相同，其中，谷子FAD2基因有2个，拟南芥中仅有1个，水稻中有3个。FAD3、FAD7和FAD8形成另一个进化分支，包含3个谷子FAD，3个拟南芥FAD和4个水稻FAD。

2.3 谷子膜结合FAD基因的基因结构分析

通过对谷子膜结合FAD基因的外显子及内含子的分布发现（表2、图2），各个亚家族成员的基因结构呈现一定的保守性，并且这种保守性与其进化关系相吻合。其中，2个FAD3成员均含有6个外显子和5个内含子；2个SLD基因都只有1个长度相近的外显子；1个FAD7成员和1个FAD6成员均含有8个外显子和7个内含子；2个FAD2成员中1个基因含有1个外显子，另一个基因含有3个外显子和2个内含子；1个DSD基因含有2个外显子和1个内含子。

表2 谷子膜结合FAD基因的进化分类及基因结构信息

2.4 谷子膜结合FAD染色体定位及其基因复制事件

表3 谷子膜结合FAD基因的染色体位置信息

通过搜索谷子基因组数据库，本研究获得了谷子膜结合FAD基因的染色体位置信息（表3），并以此绘制出膜结合FAD成员的染色体定位图（图3）。从图3可以看出，9个膜结合FAD基因分散分布在谷子的8条染色体上，其中，第3条染色体上没有膜结合FAD基因；第7条染色体上含有2个膜结合FAD基因；其他染色体上分别只有1个基因。通过分析基因复制发现，谷子FAD基因中仅有1对复制基因（SiFAD3.1/SiFAD3.2）。根据这对复制基因在染色体上的分布可知，该次复制事件属于片段复制。

3 结论与讨论

目前，膜结合FAD基因已在拟南芥、大豆[13]、水稻[23]、可可[24]、棉花[23-25]、黄瓜[26]、花生[27]、油菜[28]等植物中完成了全基因组水平上的鉴定及进化分析。随着谷子基因组数据的公布，本研究对谷子膜结合FAD基因家族进行了分析，通过检索，在谷子中共鉴定出9个膜结合FAD基因；通过利用拟南芥、水稻和谷子膜结合FAD基因的氨基酸序列构建进化树，将膜结合FAD基因划分成4个亚家族，并发现第一类脱氢酶亚家族的基因在谷子中发生了缺失。该结果暗示在植物的进化过程中不仅伴随着基因的扩增，同时也存在基因的突变和缺失[29]。其他亚家族的谷子膜结合FAD基因的数目与拟南芥和水稻相比没有明显差异。

基因结构的动态可以在一定程度上反映该基因家族的进化过程[30]。本研究中，膜结合FAD基因结构的分析结果表明，各个亚家族中外显子及内含子的数目表现出一定的保守，这种保守与其进化关系相吻合。

基因复制被认为是植物进化的动力[31]。本研究在谷子中仅发现了1对膜结合FAD复制基因SiFAD3.1/SiFAD3.2，且该次基因复制事件属于片段复制。结果说明在谷子中，膜结合FAD基因家族主要在Omega亚家族中发生了扩增，并且该扩增是由片段复制事件促成的。

综上所述，本研究对谷子中的膜结合FAD基因在基因鉴定、进化分类、基因动态结构、基因扩增等方面进行了研究，一方面有利于阐明谷子膜结合FAD基因家族的分子进化机制，同时也可为今后谷子抗逆境胁迫基因的筛选和鉴定提供理论基础。