黄花苜蓿Mfβ-Hex1基因的克隆及生物信息学分析

徐文艺，赵 彦，包 健，王俊杰

（内蒙古农业大学草原与资源环境学院,内蒙古呼和浩特 010019）

黄花苜蓿（Medicago falcataL.）作为我国北方地区一种非常重要的多年生豆科牧草,具有很强的抗逆性,营养价值高[1]、适口性好,在改善天然草地及人工草地、改良苜蓿品种、培育抗寒品种等方面起到了重要作用[2]。研究表明,适当的放牧胁迫能提高黄花苜蓿的产量,降低杂草的竞争力。然而,许多苜蓿品种不能长期放牧,使放牧受到限制[3]。GAO等[4]在研究苜蓿耐牧性中得到己糖苷酶属于上调基因,推测其可能在苜蓿耐牧性中发挥重要作用。

糖苷水解酶（Glycoside hydrolases,GH）是一类水解糖苷键的酶,它是通过内切或外切的方式来水解各种含糖化合物的糖苷键,从而生成单糖、寡糖或糖复合物。β-氨基己糖苷酶（β-Hexosaminidase,β-Hex1）属于GH20家族成员,作为一种常见的糖苷酶,广泛存在于生物界中[5]。氨基糖苷酶起着调节蛋白质活性的作用[4],该蛋白通过除去许多核和细胞质中的丝氨酸和苏氨酸残基中的O-GlcNAc单糖来参与营养响应的己糖氨基糖苷酶信号通路[4,6]。而O-GlcNAc单糖的去除极大地改变了动物和植物中靶蛋白的功能。而在这个过程中受到影响的植物蛋白会影响芽的生长发育、细胞分裂素分解代谢和干旱响应[7-8]。本研究对黄花苜蓿中的耐牧相关基因Mfβ-Hex1进行克隆和生物信息学分析,旨在为进一步研究其功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

植物材料为野生的黄花苜蓿,采集于呼伦贝尔市鄂温克旗草原站。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取与cDNA的合成 取黄花苜蓿的新鲜叶片为原料,利用普洛麦格公司的植物总RNA提取试剂盒来提取黄花苜蓿的RNA,测定其质量和浓度。再取5 μL,利用普洛麦格公司的反转录试剂盒进行cDNA的合成。

1.2.2 基因克隆 根据已知的目的基因序列利用NCBI primer设计特异性引物,引物序列如下：Mfβ-Hex1-F 5′TTGCGGGGATTAGAGACGTT3′,Mfβ-Hex1-R 5′TTTCGCAACAGCCTTTGCAC3′以黄花苜蓿的cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为：cDNA 模板 3 μL、上下游引物各 2 μL,2×Taq MasterMix 25 μL,ddH2O 18 μL。扩增条件为：95 ℃预变性2 min,95℃变性 30 s,56℃退火30 s,72℃延伸70 s,30个循环,72℃延伸7 min,4℃保温。用1%的凝胶电泳检测PCR结果。

1.2.3 PCR产物回收 PCR的产物利用天根胶回收试剂盒进行回收。将回收的产物3 μL与pGEM-T载体进行连接反应,反应时长为16 h。连接成功后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,然后用涂布器涂抹在加有氨苄青霉素的LB平板上,37℃过夜培养,挑取生长良好的单克隆菌落溶于10 μL无菌水中,取2 μL菌液进行菌液PCR鉴定,反应体系为20 μL,包括菌液 2 μL,上下游引物各 1 μL,2×Taq MasterMix 10 μL,ddH2O 6 μL。反应条件同上述PCR扩增。用0.8%的凝胶电泳检测结果。选择阳性菌株送北京六合华大基因研究中心进行测序。

1.2.4 黄花苜蓿Mfβ-Hex1基因的生物信息学分析 利用 NCBI Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对黄花苜蓿Mfβ-Hex1基因进行同源性分析,利用 ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orf-finder/）和 ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）对该基因编码蛋白质的理化性质进行预测,利用 THMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测该蛋白质的跨膜区域,利用TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进行信号肽预测,用Psort（https：//wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位,通过PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）进行Mfβ-Hex1蛋白二级结构预测。

2 结果与分析

2.1 植物总RNA的提取与质量检测

提取总黄花苜蓿RNA,结果检测有3条带（图1）,说明提取RNA质量良好,可以进行下一步实验。

图1 黄花苜蓿总RNA检测结果

2.2 Mfβ-Hex1 基因的克隆

使用苜蓿的cDNA作为模板,以特定的引物PCR扩增目的基因。电泳结果显示：产生大约750 bp的单一条带,与预期片段的大小一致（图2）。

2.3 Mfβ-Hex1 序列分析

图2 Mfβ-Hex1 PCR产物凝胶电泳图

表1 Mfβ-Hex1编码氨基酸及其含量

2.3.1 Mfβ-Hex1序列分析 利用ORF Finder结果显示从黄花苜蓿中克隆得到长786 bp的Mfβ-Hex1基因 ,获得675 bp的完整开放阅读框（图3）,编码了224个氨基酸,将其命名为Mfβ-Hex1,利用ProtParam对该蛋白质物理化学性质进行预测。结果显示,蛋白质的相对分子质量约为26.02 kD,理论等电点为5.43,其氨基酸组成见表1。其中,Glu（8.0%）、Ser（7.1%）、Leu（7.1%）、Lys（6.7%）、Ile（6.2%）、Pro（6.2%）含量较高,占全部组分的41.3%。不稳定系数为48.54,说明该蛋白为不稳定蛋白。利用InterProScan保守结构域在线软件对该蛋白进行功能结构域预测（图4）,Mfβ-Hex1属于糖苷水解酶超家族中的一类酶,具有糖苷水解酶家族GH20的功能域。

图3 Mfβ-Hex1开放阅读框序列及推测氨基酸序列

图 4 Mfβ-hex1 结构域

2.3.2 Mfβ-Hex1跨膜区域预测及亚细胞定位 用THMM预测该蛋白质无跨膜区域。用TargetP分析得SP值为0.498,小于1,推测此蛋白质无信号肽。用Psort进行亚细胞定位,预测结果显示,Mfβ-Hex1定位于细胞质中的可能性为64.2%,在叶绿体和细胞核中的可能性为14.3%,在线粒体中的可能性为7.1%。因此,推测Mfβ-Hex1定位于细胞质中（表2）。

表2 Mfβ-Hex1的亚细胞定位

2.3.3 Mfβ-Hex 1蛋白二级结构预测 通过PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）进行Mfβ-Hex1蛋白二级结构预测,结果显示：Mfβ-Hex1的二级结构主要以α-螺旋为主,β-折叠和无规则卷曲出现的概率较小（图5）。

图5 Mfβ-Hex1蛋白的二级结构

2.4 Mfβ-Hex1 同源性分析

通过NCBI Blast对 Mfβ-Hex1进行同源性分析,结果显示：Mfβ-Hex1基因与蒺藜苜蓿β-Hex1（登录号XP_013447851.1）的同源性最高,为98%,与鹰嘴豆β-Hex1（登录号XP_004492083.1）的同源性为91%,与大豆β-Hex1（登录号XP_003518662.1）的同源性为89%,与狭叶羽扇豆β-Hex1（登录号XP_019455352.1）的同源性为87%,与木豆β-Hex1（登录号XP_020231932.1）的同源性为90%,与烟草β-Hex1（登录号XP_019245516.1）的同源性为85%。

2.5 遗传距离与系统进化树构建

利用 MEGA7.0对Mfβ-Hex1与 GenBank中部分植物β-Hex1蛋白的遗传距离进行分析（图6）,并构建系统进化树（图7）,从遗传距离可以看出,黄花苜蓿Mfβ-Hex1与蒺藜苜蓿的进化距离为0.022,说明两种物种遗传关系最近。系统进化树分析显示,黄花苜蓿Mfβ-Hex1与蒺藜苜蓿的β-Hex1属于同一分支,两者亲缘关系较近。

图6 黄花苜蓿Mfβ-Hex1蛋白的遗传距离

图7 Mfβ-Hex1系统进化树分析

3 讨论

GH20基因家族一直是人们研究的热点之一。此外,GH20基因家族存在于许多物种中,在进化过程中表现出其保守性和稳定性。基因复制、重组和序列变异被称为生物进化的3个基本来源,对于研究GH20基因家族的起源和进化具有重要意义。

β-氨基己糖苷酶属于糖苷水解酶GH20家族,是一种普遍存在于生物圈中的常见糖苷水解酶。在高等植物中的研究较少,植物糖蛋白主要包含两类低糖链：寡甘露糖 N-聚糖（paucimannosidic N-glycans）和复杂N-聚糖（complex N-glycans）,绝大多数植物的糖蛋白含有大量的寡甘露糖N-聚糖[9]。在拟南芥中,β-hex分布于亚细胞的不同部位,并且在寡甘露糖N-聚糖的合成过程中起到关键作用[10]。β-hex属于N-聚糖加工酶,它在植物中广泛存在,催化位于N-糖蛋白非还原性末端的N-acetylglucosamine（GlcNAc）降解,使N-糖蛋白携带的complex N-glycans变为寡甘露糖N-聚糖。游离N-聚糖参与果实软化调节[11],JAGADEESH等[12]也认为β-hex可能作用于细胞壁或者细胞膜上的糖蛋白,释放游离N-聚糖,影响细胞壁的完整性。曹丽军[9]在研究沙红桃果实软化作用中提到,β-Hex在植物中可能存在负面的调节作用,而植物免疫系统对于该酶也具有相应的响应机制。但在WANG等[13]的研究中提到,在苜蓿中的β-氨基己糖苷酶通过除去许多核和细胞质中的丝氨酸、苏氨酸残基中O-GlcNAc单糖参与营养响应的己糖酶信号转导途径,O-GlcNAc转移酶（OGT）和O-GlcNAcase（己糖氨基糖苷酶）分别加入和去除O-GlcNAc结构,极大地改变了动物和植物中靶蛋白的功能。许多受此过程影响的植物蛋白,如赤霉素信号通路涉及的那些蛋白影响着芽的生长和发育、细胞分裂素分解代谢和干旱反应,说明该基因可能参与了赤霉素和细胞分裂素的合成。本研究从黄花苜蓿中克隆得到黄花苜蓿的β-氨基己糖苷酶基因,属于GH20家族具有糖苷水解酶家族GH20的功能域,由于在不同的生物体内含有多个β-氨基己糖苷酶参与不同的生理过程,功能也不同,所以该基因在黄花苜蓿中的具体功能还需要进一步的鉴定。

4 结论

本研究首次从黄花苜蓿中获得β-氨基己糖苷酶Mfβ-Hex1基因全长786 bp,包含675 bp的开放阅读框。编码了224个氨基酸,主要由谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸等组成。与豆科植物蒺藜苜蓿和鹰嘴豆中的β-Hex1基因具有高度同源性。Mfβ-Hex1基因属于GH20家族成员,不具有跨膜区域,其二级结构以α-螺旋为主。亚细胞定位证明主要存在于细胞质中。