白藜芦醇对肺腺癌95D裸鼠移植瘤增殖及转移的影响

陈海霞

【摘 要】本文通过皮下接种和尾静脉注射建立裸鼠皮下移植瘤及静脉转移瘤模型，采用完全随机分组方法分为生理盐水对照组和白藜芦醇组（100mg/kg），腹腔注射白藜芦醇进行治疗，NightOWLⅡLB983动物成像仪测定皮下移植瘤生长状况和肺转移灶改变，移植瘤标本进行病理学观察，免疫组化检测MMP2、TIMP2表达变化。得出白藜芦醇有抑制肺腺癌细胞增殖效应，并具有抑制肿瘤细胞侵袭、转移作用，其机制可能涉及对MMP2、TIMP2表达的调控。

【关键词】白藜芦醇;肺肿瘤;裸鼠

【中图分类号】R539【文献标识码】A【文章编号】1005-0019（2019）13-0-02

肺癌是我国发病率和死亡率占第一位的恶性肿瘤，临床上预后较差，也是近年来重要的抗肿瘤研究对象，1940年首次从毛叶叶黎芦的根部分离得到白藜芦醇（resveratrol， Res），其是一种活性非黄酮多酚物质，在植物受到病原性进攻或环境恶化时产生。近年来又发现白藜芦醇具有抗肿瘤作用，对肺癌细胞有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用，本实验主要研究白藜芦醇对肺癌移植瘤的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料与细胞株

Luciferase-95D细胞珠购自赛业生物公司;基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase， MMP2）、金属蛋白酶组织抑制剂2（tissue inhibitors of metalloproteinase， TIMP2）购自Sant Cruz公司，Matrigel购自美国BD公司;BALB/C裸鼠，6-8周龄，体重20-25g，由同济大学实验动物科学部提供等。

1.2 裸鼠饲养 裸鼠饲养于同济大学实验动物中心SPF屏障系统的洁净层流架内，相对湿度40%-60%，温度25℃，实验裸鼠所用鼠笼、垫料、食物、水等均经过消毒处理。

1.3 肺癌细胞移植瘤模型的建立 取对数生长期Luciferase-95D细胞，经消化、离心，制备5×106个/ml细胞悬液，每只裸鼠背部皮下种植0.2 ml细胞悬液形成皮下移植瘤，尾静脉种植0.2ml细胞悬液形成肺转移瘤，待瘤增长至100mm3，按完全随机分组方法将裸鼠分成对照组和白藜芦醇组，分组5只，进行给药，白藜芦醇组给于100mg/kg/d，对照组给于等体积的生理盐水对照，给药途径均为腹腔注射，每天1次，每5天活体荧光成像仪测量一次肿瘤结节的光量子强度，绘制各组腫瘤的生长曲线。

1.4 移植瘤组织病理学观察 末次给药6 h后实验结束将裸鼠拉颈处死，取皮下移植瘤和肺转移瘤，10%的福尔马林固定过夜，标本经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤常规制备出瘤组织石蜡切片，经过苏木精-伊红染色，应用光学显微镜观察各组移植瘤组织结构的变化。

1.5 免疫组织化学检测移植瘤MMP-2、TIMP-2的表达 制备好的石蜡切片脱蜡，按免疫组织化学反应步骤操作：第一抗体基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶抑制剂-2均为1∶200稀释;山羊抗兔二抗（辣根过氧化物酶标记）稀释度1∶300，各步骤间用PBS充分浸洗，30%甘油封片，显微镜下观察。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验，计量资料符合正态分布，使用表示，检验水准α=0.05。

2 实验结果

2.1 裸鼠治疗前后一般情况变化 应用白藜芦醇治疗期间裸鼠进食、饮水等均未发生明显变化，但是随治疗时间的延长，白藜芦醇实验组个别裸鼠体重减轻明显，有的裸鼠出现短暂的腹泻、便血，无需治疗，停药后既可自行缓解，考虑胃肠道受药物刺激所致，实验期间裸鼠均未出现意外死亡。

2.2 白藜芦醇对裸鼠移植瘤的抑制作用 裸鼠用药期间每5天一次活体荧光成像仪观察结果显示，对照组皮下移植瘤生长较快，白藜芦醇处理组肿瘤生长缓慢，实验组与对照组有显著差异（P<0.01）;尾静脉肺转移瘤观察，可见对照组肺部瘤结节较实验组多且大。白藜芦醇处理组瘤结节小，多为0-2个，说明白藜芦醇对肺癌转移有一定抑制效应。

2.3 裸鼠瘤组织病理学观察白藜芦醇诱导裸鼠肺癌移植瘤细胞凋亡情况

对照组皮下移植瘤切片中肿瘤细胞呈上皮样，内外膜完整，核浆比例高，分裂象多见，未见明显坏死灶;白藜芦醇治疗组，瘤块中癌细胞排列较紊乱，可见大量核固缩或碎裂的瘤细胞，瘤组织间有较多的片状坏死灶，并可见炎症细胞浸润。肺组织切片显示，肺组织内有大量转移瘤灶，部分相互融合，肺组织实变;并可见瘤细胞侵犯血管和气管壁;Res组肺组织中仅见到少量小瘤结节，肺组织结构完整，部分可见肺泡隔充血。

2.4 免疫组织化学检测白藜芦醇对MMP2、MMP11、TIMP2表达的变化

裸鼠移植瘤石蜡切片免疫组化染色结果显示，MMP2蛋白表达随白藜芦醇浓度的增加表达下降，TIMP2则升高，可能与肺癌转移有关。

3 讨论

白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，其化学名称3，4，5'-三羟基苯二烯，是一种活性非黄酮类多酚化合物，已在72中植物中被发现，近年来备受关注，体外及动物体内实验结果表明白藜芦醇能抑制肿瘤细胞的生长，具有抗肿瘤活性，是非常有前景的天然抗肿瘤药物，被喻为又一新的绿色抗肿瘤药物[]。本研究结果显示也证明白藜芦醇可抑制裸鼠移植瘤的生长并促进其细胞凋亡。

侵袭和转移是恶性肿瘤最本质的特征和最普遍的一种生物学行为，是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程[]，涉及肿瘤细胞粘附，对细胞外基质的降解，新生血管的长入。本研究显示，裸鼠移植瘤细胞MMP-2表达下降，而TIMP-2表达增高，由此可以抑制95D细胞对基膜降解和基膜的黏附，降低肿瘤细胞侵袭转移能力。因此，MMP2/TIMP2的表达水平有可能作为预测肺癌恶性程度的生物学指标。

总之，本研究通过体内外实验证实白藜芦醇具有抑制肺癌的增殖和转移作用，下调移植瘤细胞MMP2的表达，同时上调TIMP2的表达可能是白藜芦醇抑制肺癌转移的机制之一，为肿瘤治疗提供新的选择，但其抗肿瘤侵袭、转移机制有待进一步研究明确。

参考文献

刘红山， 潘承恩， 齐咏， 等. 白藜芦醇合用5-FU对小鼠移植肝癌H22生长的影响[J]. 世界华人消化杂志， 2002， l0（1）： 32-35

Yokota J.Tumor progression and metastasis.Carcinogenesis.2000， 21（3）：497—503.