滇黄精组培褐化影响因素研究

苏 娟，张万巧，王 晓，李昆华，韩 郸，杨 丹，岳 健

(云南山里红生物科技有限公司，云南 昆明 650200)

滇黄精Polygonatum kingianum为百合科Liliaceae 黄精属Polygonatum的多年生宿根性草本药用植物[1—3]，主要分布于广西、四川、贵州、云南等地区。始载于《名医别录》，其根状茎性平、味甘，具补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效，用于阴虚肺燥，阴血不足和脾胃虚弱之症[4]。

滇黄精目前主要来源野生采挖，资源存量大幅减少，但需求持续旺盛，供求不平衡持续加剧。因此，利用植物组织培养技术加快人工繁殖速度，对其资源保护及产业化开发具有重要意义。前人对滇黄精的组织培养研究较多[5—7]，但有关褐化现象的研究较少[8]。本研究分析滇黄精组培的褐化问题，并对其褐化控制措施进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

滇黄精带芽块茎采自云南山里红生物科技有限公司种质资源基地(泸西)。于当年3 月至4 月，从块茎上切取新萌芽作为外植体材料。

1.2 方法

1.2.1外植体滇黄精根茎洗净，裁成1.2 cm×1.2 cm 带新萌芽小块，置于洗洁精水溶液中浸泡15 min，用流水冲洗1 h，再用洗洁精摇晃清洗5 min，在超净台上消毒，用无菌水充分清洗，无菌滤纸吸干。经不同消毒方式灭菌后，用无菌水清洗5 次，将植物组织暴露在消毒液中的部分切除后外植体大小约为1 cm×1 cm，接种至培养基，每瓶接种外植体1 个，每处理10 瓶，重复3 次。

1.2.2不同消毒时间处理先用75%乙醇进行表面消毒30 s，再用0.1%氯化汞，2%次氯酸钠两种消毒剂处理，各设置5 个时间处理，即6 min、8 min、10 min、12 min、14 min。

1.2.3不同消毒方式处理设三种消毒方式：均用75%乙醇进行表面消毒30 s，再用0.1%氯化汞处理10 min；2%次氯酸钠处理12 min；0.1%氯化汞处理8 min＋2%次氯酸钠处理12 min。

1.2.4基本培养基及培养条件分三种基本培养基进行设计，分别为MS、1/2MS、1/4MS。培养基均添加6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、活性炭0.1 mg·L-1、琼脂6 g·L-1，pH=5.8。培养条件光照1500 lx，光照周期12 h·d-1，温度(24±2) ℃，在常规组培室进行，培养30 d 后观察外植体褐化情况，并计算褐化率和获得率。褐化率为褐化株数占接种总数百分比，获得率为未污染未褐化株数占接种总数百分比。数据处理采用SPSS 18.0 进行单因素方差分析[9]。

1.2.5不同温度处理设20、25、30 ℃三种温度，在智能人工气候培养箱中进行。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对外植体褐化的影响

2.1.1氯化汞灭菌对外植体褐化的影响滇黄精外植体经过75%乙醇处理30 s 表面消毒后，再用0.1%氯化汞进行不同时间处理，统计褐化率和获得率如表1。随着消毒时间增加，褐化率呈递减趋势，获得率呈先增后减趋势，消毒处理10 min 的获得率最高。综合来看，0.1%氯化汞处理10 min 消毒效果最好。

2.1.2次氯酸钠灭菌对外植体褐化的影响滇黄精外植体经过75%乙醇处理30 s 表面消毒后，再用2%次氯酸钠进行不同时间处理，统计褐化率和获得率如表2。随着消毒时间的增加，褐化率呈先减后增趋势，获得率呈先增后减趋势，处理12 min 获得率最高。综合来看，2%次氯酸钠处理12 min 效果最好。

2.2 不同灭菌方式对外植体褐化的影响

试验均用75%乙醇表面消毒30 s，然后以氯化汞和次氯酸钠进行深度灭菌，培养7 d 后不同灭菌方式处理的褐化率和获得率见表3。通过2%次氯酸钠12 min+0.1%氯化汞10 min 消毒外植体的抗褐化效果最好，获得率最高。

表1 氯化汞灭菌对外植体材料褐化的影响Table 1 Effect of mercuric chloride sterilization on browning of explants

表2 次氯酸钠灭菌对外植体材料褐化的影响Table 2 Effect of sodium hypochlorite sterilization on browning of explants

表3 不同消毒方式对外植体材料褐化的影响Table 3 Effects of different disinfection methods on browning of explants

2.3 不同基本培养基对外植体褐化的影响

将外植体根茎芽灭菌后接种至不同培养基，培养7 d 后统计褐化率和获得率。由表4 可知，不同基本培养基褐化率与获得率均差异显著，其中1/4MS 褐化率最高，达43.33%，1/2MS 褐化率最低，为23.33%；就获得率而言，1/2MS 最高，为46.11%；其次是MS，1/4MS 的最低。

2.4 不同温度处理对外植体褐化的影响

以外植体接种后光照1500 lx，光照周期12 h·d-1，温度(24±2) ℃下培养作为空白对照。由表5 可知，在不同温度处理下，与对照相比，褐化率最低为20℃，为29.66%，获得率最高为20℃，为40.03%，对照与30 ℃处理差异不显著。由此可见，低温环境能抑制滇黄精外植体褐化。

表4 不同基本培养基对外植体材料褐化的影响Table 4 Effects of different basic mediums on browning of explants

3 结论与讨论

表5 不同温度处理对外植体材料褐化的影响Table 5 Effect of different temperature treatment on browning of explants

在药用植物组织培养过程中，一般通过选择适当的外植体、消毒方法、培养基和生长调节剂，控制培养温度和光照，培养基中添加抗氧化剂和吸附剂，加快继代转瓶速度等综合手段防止褐化[10—11]。本试验探讨消毒时间、消毒方式、基本培养基及温度对外植体褐化的影响，结果表明，随着消毒时间增加，使用HgCl2处理10 min、NaClO 处理12 min 抗褐化效果明显，采用75%乙醇处理30 s，NaClO 12 min+ HgCl28 min 消毒，抗褐化效果最好；采用1/2MS 为基本培养基的抗褐化效果比MS、1/4MS 基本培养基的抗褐化效果好，这与张振霞等[12]在番荔枝中的研究结果一致。邱璐等[13]在云桑组织培养中亦发现，使用1/2MS 培养基，降低无机盐浓度，能有效减轻褐化现象，降低褐化率。在滇黄精组织培养过程中对其进行低温处理能明显降低褐化率，温度越低，抗褐化效果越好，这与Huang 等[14]、赵伶俐等[15]的结论一致。

在药用植物组织培养过程中，影响外植体褐化的因素较多，本试验初步探索消毒方式、基本培养基及培养温度对滇黄精根茎芽组织培养过程中褐化的控制效果，发现先经过75%乙醇处理30 s 消毒表面，再用NaClO 12 min+HgCl28 min 消毒的抗褐化效果最好；选用1/2MS 基本培养基能有效降低褐化率；低温环境(20 ℃)能进一步减少褐化的发生。