山东省6例猪圆环病毒3型检测及Cap结构遗传进化分析

刘晓东，郝尧光，马振乾，李 坤，董雅琴，高 丰

(1.吉林大学动物医学学院，吉林 长春 130062；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266000；3.青岛易邦生物工程有限公司，山东 青岛 266000）

猪圆环病毒属于圆环病毒科是一种环形单链DNA病毒，PCV无囊膜，呈球状的二十面体对称结构，由衣壳蛋白（Cap）和基因组组成[1-2]。2016年前，国内仅发现PCV1和PCV2两个基因型。PCV1无致病性，PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、仔猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征以及繁殖障碍等疾病的病因。临床上，PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪肺炎支原体等病原混合感染，造成养猪业巨大经济损失[3-10]。2016年美国首次在病猪体内鉴定出PCV3[11]。随后在2017年我国也不断报道PCV3的存在[12-13]。但在山东省内PCV3的流行情况还不清楚，因此研究PCV3的遗传进化，为PCV3分子遗传进化和有效防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品

2018 年采集山东省6 份具有临床表现繁殖障碍和呼吸道疾病的猪的PCV3阳性病料，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂

2×Taq MasterMix，r Taq DNA聚合酶、DL2000DNAMarker和MiniBEST Universal Genomic DNA Ex-traction Kit Ver.5.0等均购自TaKaRa 公司与宝生物工程（大连）有限公司，DNA回收试剂盒购自北京鼎国昌盛生物公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.3 病毒核酸的提取

所取检测样品为发病猪的肺脏、脾脏及淋巴结剪碎后充分匀浆，于－20 ℃冰箱反复冻融3次。取700 μL匀浆液上清[14]，使用酚氯仿法抽提 DNA，每个样品用50 μL双蒸水溶解，保存于－20 ℃冰箱。

1.4 PCR 扩增

以提取的病料样品基因组DNA为模板，扩增PCV3的目的基因。上游引物序列 F：5'-TTACTTAGAGAACGGACTTGT AACG-3'，下游引物R：5'-AAATG AGACACAGAGCTATATTCAG-3'。反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPMixture (2.5 mmol/L) 2 μL，各上、下游引物各0.8 μL，模板 DNA 2 μL，r Taq (5 U/μL) 0.2 μL，ddH2O 补足 25 μL。PCR 反应程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、50 ℃～58.5 ℃ 45 s、72 ℃ 1～2 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物大小为651 bp。

1.5 基因测序分析

序列分析 以DNAStar中的Megalign比对山东分离的PCV3毒株与GenBank已公布PCV1、PCV2和PCV3参考毒株的Cap基因序列同源性，并预测Cap蛋白信号肽、糖基化位点等遗传进化。

2 结果

2.1 样品阳性率及混感情况

对2018年的6份PCV3阳性样品进行检测发现：在繁殖障碍、呼吸道症状及消瘦的临床症状中均能检测到PCV3的存在（如表1）。

2.2 凝胶电泳结果

对病料组织进行PCR检测，结果显示：6病料均为阳性，扩增产物大小为 651 bp，与引物设计一致。

表1 PCV3的检测结果

图1 病料RT-PCR产物电泳图

2.3 核苷酸及氨基酸同源性

通过DNAStar-Megalign程序对序列进行比对，结果显示，山东省6株PCV3 Cap基因之间的核苷酸序列同源性为98.3%～99.8%，编码的氨基酸序列同源性为98.6%～99.7%；与PCV1核苷酸序列同源性为35.1%～35.4%，编码的氨基酸序列同源性为33.9%～35.7%；与PCV2核苷酸序列同源性为：34.4%～38.6%，编码的氨基酸序列同源性为33.9%～38.1%。与美国参考株的核苷酸序列同源性为97.3%～99.8%，编码的氨基酸序列同源性为97.7%～99.7%（如图2、图3）。

2.4 进化树

对6株分离毒株与参考毒株通过进化树对比发现2株属于PCV3a，4株属于PCV3b，说明山东PCV3毒株既有PCV3a也有PCV3b(为标准毒株，没有标为检测毒株)（如图 4）。

2.5 遗传进化情况

所分离的6株PCV3与美国毒株仅存在散在变异位点，但与PCV1及PCV2抗原表位差异明显，说明PCV3的保守性较好，该病毒在进入中国后并没有发生进一步的重组进化，但与PCV1及PCV2差异较大（如图5与图6）。

3 讨论

通过对PCV3阳性病料进行分析发现，此次PCV3阳性病料以繁殖障碍、消瘦及呼吸道症状为主与其他病症相似，这给临床诊断带来了一定困难。

通过同源性对比发现山东分离的PCV3与PCV1及PCV2同源性较低只有30%左右，山东PCV3通常既有PCV3a也有PCV3b，与美国毒株同源性很高达到97%以上；对其Cap蛋白基因分析发现只存在零散碱基突变，可以推测：山东省内的PCV3并没有太大变异情况发生。这与 Palinski R结论一致[15]。

对山东分离毒株的PCV3 Cap蛋白质与PCV2 Cap蛋白质的氨基酸残基比较分析，在Cap蛋白N端均含有大量精氨酸残基和稀有密码子,但Cap蛋白的B细胞抗原表位差异明显，无相似性，Cap蛋白结构及抗原性存在明显差异，因此推测PCV2和PCV3间交叉保护水平较低,说明现有的猪圆环病毒疫苗基本不能给予PCV3有效保护。此结论与Shang得出PCV3 Cap蛋白氨基酸比PCV2 Cap蛋白氨基酸序列缺失掉了8个氨基酸，而这8个氨基酸位于病毒衣壳的外表面位置，这个位置更适合外源抗原表位的插入，PCV3毒株和PCV2毒株的抗原交叉保护性极低的结论推断一致[16]。

图2 核苷酸同源性

图3 氨基酸同源性

图4 进化树分析

图 5 PCV3 核苷酸分析

图 6 PCV3 氨基酸分析

4 结论

我国对于PCV3的研究尚处于起步阶段，需对PCV3进行大量的研究及检测，通过对山东省发病场的PCV3调查，证明PCV3在山东省也存在，且症状复杂，同时PCV3和PCV2间交叉保护水平较低,现有的猪圆环病毒疫苗基本不能给予PCV3有效保护，在没有有效疫苗进行防控期间我们必须要坚持“早发现、早报告、早隔离、早诊断、早扑灭”原则做好安全措施，保证猪群健康，同时跟踪监控好PCV3的流行及变异情况，为科学防控提供参考数据。