分子蒸馏对沙棘果油中8 种塑化剂组分脱除及综合品质的影响

刘玉兰，陈 莉，张小龙，张振山，马宇翔

（1.河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001；2.甘肃陇源红生物科技有限公司，甘肃 定西 748201）

沙棘属胡颓子科（E l a e a p n a c a e）沙棘属（Hippophae）落叶灌木或小乔木，因其具有耐旱、耐盐碱、抗风沙的生长习性，在中国、蒙古、俄罗斯等国家的高原地区均有种植[1]。我国是沙棘属植物分布区面积最广、种类最多的国家，内蒙古、甘肃、陕西等地区是主要产地。沙棘含有丰富的营养和生物活性物质，是生产沙棘饮料、果油、保健品、药物等产品的良好原料[2-5]，其中沙棘果油是从沙棘果实的果肉中提取的油脂，富含类胡萝卜素、VE、黄酮类、有机酸、甾醇等100多种生物活性物质[6-7]。研究表明，沙棘果油具有保肝[8]、降血压[9-10]、调节肥胖[11]、抗氧化[12]、愈合伤口[13]等功效，常被制作成保健产品及临床药物。

邻苯二甲酸酯类（phthalic acid esters，PAEs）塑化剂是一类普遍使用的塑料加工助剂，因其易从塑料产品中迁移出来而广泛存在于空气、水体及土壤中[14]。PAEs组分的分子结构类似于荷尔蒙，能通过分子对接与血红蛋白结合[15]，过多的PAEs摄入及其在人体内的长期积累会严重危害机体健康，尤其是延迟儿童生长发育、降低成年男性精子质量、增加成年女性患乳腺癌的几率等[16-19]。欧盟、美国、澳大利亚、日本等地区对儿童玩具、饮用水、食品包装中PAEs的几种组分如邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯（bis(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP）、邻苯二甲酸二正丁酯（di-butyl phthalate，DBP）、邻苯二甲酸丁基苄酯（benzyl butyl phthalate，BBP）、邻苯二甲酸二异壬酯（diisononyl phthalate，DINP）、邻苯二甲酸二异癸酯（di-isodecyl phthalate，DIDP）和邻苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DNOP）的使用量均作出限制[20]。我国GB 9685—2016《食品安全国家标准 食品接触材料及制品用添加剂使用标准》中规定DBP、DEHP、DINP向食品中的最大迁移限量分别为0.3、1.5、9.0 mg/kg。

受环境中和塑料包装材料中PAEs的影响，植物油料及其毛油均可能或多或少地含有PAEs组分[21]。此前，本实验室已对食用植物油中PAEs的吸附脱除[22]、水蒸气蒸馏脱除[23]及分子蒸馏法脱除[24]工艺技术和脱除效果进行了研究，发现因分子蒸馏独特的组分分离原理[25]能够在高温、高真空和极短时间内完成对植物油中PAEs的高效脱除。但之前研究的油脂样品并未涉及沙棘果油，且分子蒸馏脱除PAEs油样中PAEs超标量也不明显（DEHP含量2.996 mg/kg，超标1 倍）[24]，对PAEs含量超标幅度明显的油脂中PAEs的脱除没有研究，也鲜见相关的文献报道。受生长环境、采摘方式、贮存方法等因素的影响[26]，沙棘果油可能存在较大的PAEs超标风险。鉴于沙棘果油特殊的食用及医用价值，其PAEs超标风险不容忽视。因此，本研究以气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法检测沙棘果油中8 种PAEs组分（邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、BBP、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate，DIBP）、DBP、DEHP、DINP、DNOP）含量（依据前期研究及文献[21]报道，这8 种PAEs组分容易在食用植物油中残留），并设计两级分子蒸馏工艺对沙棘果油中PAEs进行脱除，目的是将沙棘果油中可能存在的高含量PAEs脱除至GB 9685—2016限量以下，确保并提高其品质安全；同时，考察分子蒸馏过程对沙棘果油中VE、甾醇、黄酮类等活性成分保留及脂肪酸组成的影响，为食用植物油中高含量PAEs精准可靠脱除工艺技术的建立提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘果毛油取自甘肃陇源红生物科技有限公司，其可能因原料沙棘果在采摘后用劣质塑料袋盛放、贮存，致使沙棘果油受到塑化剂污染。

DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP、DNOP标准品（纯度≥98.0%）、DIBP、DINP标准品（纯度99.0%）德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；7 种氘代同位素内标（d4-DMP、d4-DEP、d4-DIBP、d4-DBP、d4-BBP、d4-DEHP和d4-DNOP）（纯度≥99%） 上海有机化学研究所有机质谱中心；胆甾烷醇（纯度≥95%）、N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺、1%三甲基氯硅烷 美国Sigma公司；α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-生育三烯酚标准品（纯度≥99%）、亚羊子酸、羊子酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、亚麻酸、山嵛酸、芥酸、木焦油酸标品（纯度≥95%） 北京三区生物技术有限公司；正己烷、甲醇、丙酮（色谱纯） 美国VBS生物公司；GF254高效薄层硅胶板 青岛海洋化工厂分厂；三氟化硼、无水硫酸钠、三氯甲烷、氢氧化钠、氯化钠均为国产分析纯；实验所用水均为超纯水（电导率为18.25 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

Trace1310-ISQ GC-MS仪、TG-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Thermo Fisher公司；e2695液相色谱仪、2475荧光检测器 美国Waters公司；7890B GC-氢火焰离子检测器 美国Agilent公司；Pro-Elut N-正丙基乙二胺固相萃取柱（PSA固相萃取柱，填料质量1 g、空柱体积6 mL） 上海安谱科学仪器有限公司；R-201II旋转蒸发器 上海申顺生物科技有限公司；MTN-2800W氮吹浓缩仪 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；MVS-1漩涡混合器 北京金北德工贸有限公司；LD5-10低速离心机 北京京立离心机有限公司；分子蒸馏装置 德国UIC公司。

1.3 方法

1.3.1 分子蒸馏法脱除沙棘果油中PAEs

参考刘玉兰等[24]的方法，向分子蒸馏装置的进料器中加入沙棘果油，逐次打开旋片泵、扩散泵，使真空系统的真空度为0.1 Pa，打开加热器到设定蒸馏温度（200 ℃），调节物料流速至50 滴/min，刮膜转速至190 r/min，对沙棘果油进行分子蒸馏。收集经一级蒸馏的沙棘果油（记为MD1-SPO），取样保存于4 ℃冰箱，待测。对MD1-SPO进行二级蒸馏（蒸馏条件同一级蒸馏），得到经两级蒸馏的沙棘果油（记为MD2-SPO），置于4 ℃冰箱中保存，测定其中PAEs组分含量和VE、甾醇、总黄酮含量。分别按式（1）、（2）计算PAEs脱除率及活性成分保留率。

1.3.2 沙棘果油中PAEs组分含量测定

参照GB 5009.271—2016《食品安全国家标准 食品中邻苯二甲酸酯的测定》及文献[27]中方法进行测定。

1.3.2.1 8 种PAEs组分的标准曲线绘制、线性范围及检测准确性验证

标准溶液的配制：将1 000 mg/L 7 种PAEs（DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP、DNOP、DIBP）和10 000 mg/L DINP混合标准品溶液用正己烷稀释成100 mg/L（DINP为1 000 mg/L）的混合标准品储备液，于4 ℃冰箱中保存备用。再将7 种氘代同位素内标混合液用正己烷稀释成1.0 mg/L的内标储备液，4 ℃冰箱中保存备用。分别准确移取上述8 种混合标准品储备液各1、5、10、50、100、200、500 μL和上述7 种氘代同位素内标混合液1 mL于10 mL容量瓶中，用正己烷分别稀释成0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L工作液（DINP工作液质量浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、20、50 mg/L），其中内标质量浓度均为0.1 mg/L，将稀释好的工作液进行GC-MS检测。

为验证该检测方法对沙棘果油中8 种PAEs定量检测的准确性，对沙棘果油进行低、中、高3 个不同质量浓度的加标回收实验，加标量分别为0.1、1.0、2.0 mg/kg（DINP的加标量分别为1、10、20 mg/kg），然后采用1.3.2.2节中的方法检测加标样品中8 种PAEs的含量，每个加标量平行测定6 次，计算加标回收率及相对标准偏差。

1.3.2.2 沙棘果油中PAEs组分含量的测定

样品前处理：称取1.000 0 g油样于10 mL玻璃试管中，加入100 μL氘代同位素内标，再向其中移入5 mL乙腈，漩涡振荡2 min，超声2 min，4 500 r/min离心2 min，收集萃取液于旋蒸瓶中，重复上述操作2 次，合并3 次萃取液旋转蒸发至干，加入2 mL正己烷复溶，以备净化。将复溶液过PSA固相萃取柱，而后依次加入正己烷、丙酮-正己烷（体积比1∶9）各5 mL洗脱，合并净化液和洗脱液，在40 ℃下旋转蒸发浓缩，氮气吹干，用乙腈定容至1 mL，待进样检测。

G C条件：T G-5 M S气相毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯度氦气（纯度99.99%），载气流速1 mL/min；进样口温度：300 ℃；升温程序：初始温度60 ℃保持1 min，然后以20 ℃/min升至220 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持4 min；进样量：1 μL；不分流进样。

MS分析条件：电子轰击离子源；电离能量70 eV；离子源温度300 ℃；传输线温度300 ℃；灯丝电流25 μA，溶剂延迟6 min；全扫描定性，离子扫描定量。

1.3.3 沙棘果油中VE组分含量测定

VE组分含量参照GB/T 26635—2011《动植物油脂生育酚及生育三烯酚含量测定高效液相色谱法》及文献[28]中方法进行测定。

样品前处理：准确称取0.500 0 g油样于10 mL容量瓶中，用色谱纯的正己烷定容，漩涡振荡2 min，超声5 min，静置一段时间后过0.22 μm滤膜于进样小瓶中，采用高效液相色谱仪检测。

高效液相色谱条件：检测器为2475荧光检测器；色谱柱为Spherisorb NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为正己烷-异丙醇（体积比99∶1）；流速：0.8 mL/min；柱温40 ℃；激发波长298 nm；发射波长325 nm。

1.3.4 沙棘果油中甾醇含量测定

参照GB/T 25223—2010《动植物油脂 甾醇组成和甾醇总量的测定 气相色谱法》中方法。

样品前处理：加2 mg/mL内标于10 mL螺盖试管中，氮气吹干。称取2 g样品于50 mL圆底烧瓶，加入4 mol/L KOH-乙醇溶液20 mL皂化2 h。用正己烷（40 mL/次）提取不皂化物，收集3 次萃取液，加水洗涤至中性。加无水硫酸钠除水。将萃取液倒入圆底烧瓶，蒸出溶剂，加0.4 mL氯仿复溶点板（展开剂为正己烷-乙醚（体积比65∶35）），跑板。喷荧光显色剂，刮出甾醇带，加5 mL氯仿溶解，用15 mL左右的乙醚（或者正己烷）分次润洗过滤，旋转蒸发至干后加1 mL丙酮转移至小试管，氮气吹干，加200 μL衍生剂，85 ℃水浴衍生50 min，氮气吹干，加1 mL正己烷，无水硫酸钠去水，吸取上清液过0.22 μm滤膜待GC分析。

GC条件：HP-5毛细管色谱柱（30.0 m×250 μm，0.25 μm），进样口温度300 ℃；载气为高纯氮气，分流比20∶1，流速1.0 mL/min；升温程序：285 ℃保持30 min，以10 ℃/min的速率升温至300 ℃，保持5 min；氢火焰离子检测器温度360 ℃；进样量1 μL。

1.3.5 沙棘果油中总黄酮含量的测定

参考SN/T 4592—2016《出口食品中总黄酮的测定》中方法并作部分修改。

标准曲线的建立：将20 mg芦丁标准品用70%乙醇溶液溶解并定容至200 mL容量瓶中，作为芦丁标准品溶液。精确吸取芦丁标准品溶液1、2、3、4、5 mL分别置于5 支具塞试管中，补水至5 mL。加质量分数5% NaNO2溶液0.3 mL，振荡摇匀后静置6 min；加质量分数10% Al(NO)3溶液0.3 mL，摇匀后静置6 min；加质量分数4% NaOH溶液4 mL和0.4 mL H2O，摇匀静置15 min后在510 nm波长处测吸光度，绘制吸光度-浓度曲线并计算回归方程。回归方程为：y＝1.25x-0.002 7，R2＝0.999 9。

样品中总黄酮含量的测定：精确称取1 g样品，在70 ℃下用体积分数70%乙醇以80∶1的液料比提取180 min，浸提3 次，合并浸提液，按照标准曲线相同方法测定其吸光度，按照回归方程计算总黄酮含量。

1.3.6 沙棘果油的脂肪酸组成及游离脂肪酸测定

1.3.6.1 脂肪酸组成测定

参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》中方法，脂肪酸甲酯化使用三氟化硼法[29]。

GC条件：检测器为氢火焰离子化检测器；色谱柱为HP-88（100 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：140 ℃保持5 min，4 ℃/min升至240 ℃，保持30 min；进样口温度260 ℃；检测器温度280 ℃；分流比50∶1；进样量1 μL。

1.3.6.2 游离脂肪酸质量分数的计算

参照GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》中方法滴定油样，按公式（3）计算游离脂肪酸质量分数（以油酸计）。

式中：V为消耗KOH标准溶液的体积/L；c为KOH标准溶液的浓度/（mol/L）；282为油酸的摩尔质量/（g/mol）；m为样品质量/g。

1.4 数据统计与分析

本研究中8 种PAEs标准曲线的绘制由GC-MS系统自带软件Xcalibur完成，数据计算由Excel 2013软件完成，方差分析由SPSS 20.0软件给出，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 8 种PAEs的标准曲线、线性范围及检测准确性

用内标法对DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP、DNOP、DIBP 7 种PAEs组分进行定量，以标准溶液中目标物的浓度/内标物的浓度为横坐标，标准溶液中目标物的峰面积/内标物峰面积为纵坐标绘制标准曲线。采用外标法对沙棘果油中的DINP进行定量，以标准溶液中目标物的浓度为横坐标，标准溶液中目标物的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。线性方程和决定系数由Xcalibur软件给出。以10 倍信噪比计算定量限，3 倍信噪比计算检出限。沙棘果油中8 种PAEs的保留时间、标准曲线、R2、检出限及定量限见表1。沙棘果油的加标回收实验显示，8 种PAEs的3 个不同质量浓度的加标回收率范围为86.7%～109.1%，相对标准偏差2.12%～9.22%，符合实验要求。

表1 8 种PAEs的线性范围、回归方程、R2及定量限、检出限Table 1 Retention times, regression equations, coeff l cient of determination (R2), limits of detection, limits of quantitation and concentration ranges for 8 PAEs

2.2 分子蒸馏对沙棘果油中PAEs的脱除效果

表2 分子蒸馏前后8 种PAEs组分含量及脱除率Table 2 Contents and removal rates of 8 PAEs in SPO

从表2可见，R-SPO中含有除BBP之外的7 种PAEs组分，其中GB 9685—2016有明确限量的DBP、DEHP和DINP含量分别为1.626、10.933、5.242 mg/kg，DBP和DEHP含量分别超出GB 9685—2016限量4.42 倍和6.29 倍。

MD1-SPO中DMP、DEP、DNOP几乎被完全脱除，均呈未检出状态，DIBP、DBP、DEHP、DINP含量分别降低至0.033、0.071、3.434、2.413 mg/kg，脱除率分别为99%、96%、69%、54%，说明分子蒸馏对沙棘果油中PAEs具有较好的脱除效果，这与刘玉兰等[24]所得结论一致。MD1-SPO中DBP含量远低于GB 9685—2016限量，但DEHP含量依然超出GB 9685—2016限量，因此需要对MD1-SPO进行二级分子蒸馏。

MD2-SPO中的DIBP未检出，DBP、DEHP、DINP残留量分别降低至0.036、0.668、0.802 mg/kg，均显著低于GB 9685—2016限量。经两级分子蒸馏，DBP、DEHP、DINP的脱除率分别为98%、94%、85%。

由此可见，两级分子蒸馏可将沙棘果油中高含量的DBP、DEHP脱除至远低于GB 9685—2016限量的水平。相较于水蒸气蒸馏脱除[23]，分子蒸馏技术是一种更可靠、更有效的对食用植物油中高含量PAEs精准脱除的方法。

2.3 分子蒸馏对沙棘果油中活性成分的影响

沙棘果油的营养及药用价值基于其富含的多种活性成分[30]，为综合考察分子蒸馏对沙棘果油活性成分的影响，对分子蒸馏前后沙棘果油中VE、甾醇、总黄酮含量进行检测，结果如表3所示。R-SPO富含VE，总量高达204.96 mg/100 g，4 种生育酚和4 种生育三烯酚组分均有检出，且组分齐全，其中以α-生育酚含量最高，约占VE总量的55.8%，这与侯霄[31]所得结论一致。R-SPO中甾醇总量为1 244.11 mg/100 g，主要组分为β-谷甾醇，这与Li Zheng等[32]的结论一致。总黄酮含量为426.06 mg/100 g。

表3 分子蒸馏前后沙棘果油中活性成分含量Table 3 Bioactive composition of SPO before and after molecular distillation mg/100 g

经一级分子蒸馏，MD1-SPO中VE、甾醇、总黄酮的损失严重，保留率分别为35%、55%、63%；经两级分子蒸馏，与R-SPO相比，MD2-SPO中VE、甾醇、总黄酮保留率分别降为14%、32%、46%。可见分子蒸馏会造成沙棘果油中活性成分较严重的损失，原因可能是在此蒸馏条件下，VE、甾醇、黄酮等组分与PAEs组分有相近的自由程，均会在冷凝面冷凝并一起进入轻馏分相中。根据张明明等[22]对茶籽油中塑化剂进行分子蒸馏脱除的结果，在茶籽毛油中DMP、DEP、DIBP、DBP、DEHP含量分别为1.731、1.681、6.089、6.695、2.996 mg/kg（DBP和DEHP含量分别超出GB 9685—2016限量21.3、1.0 倍）时，在与本研究同样的工艺条件下分子蒸馏一次后，DBP和DEHP脱除率达到97.3%和71.5%，含量分别降至0.179、0.853 mg/kg，均低于GB 9685—2016限量，VE总量保留率为53.6%。结合本研究结果，应视油脂中DBP和DEHP的超标程度合理选用一级分子蒸馏或两级分子蒸馏，在保证DBP和DEHP脱除达标的同时尽量减少VE等活性成分损失。

2.4 分子蒸馏对沙棘果油脂肪酸组成及游离脂肪酸的影响

对分子蒸馏前后沙棘果油的脂肪酸组成及游离脂肪酸质量分数进行测定，结果如表4所示。检出的主要脂肪酸类型为豆蔻酸（C14∶0）、棕榈酸（C16∶0）、棕榈一烯酸（C16∶1）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、亚油酸（C18∶2）、亚麻酸（C18∶3）、花生一烯酸（C20∶1），其中棕榈酸、棕榈一烯酸、油酸是其主要脂肪酸，不饱和脂肪酸质量分数为64.65%，这与杨明轩等[33]所得结论一致。分子蒸馏对游离脂肪酸质量分数有显著的影响，其经一级分子蒸馏后从5.69%降至1.20%，经二级分蒸馏后降至0.33%。从表4中可以看出，分子蒸馏前后沙棘果油的脂肪酸组成变化很小，且两次分子蒸馏均未产生反式脂肪酸，但游离脂肪酸质量分数分别降低了4.49%和5.36%，表明分子蒸馏在脱除高浓度塑化剂的同时也可能脱除部分脂肪酸。

表4 分子蒸馏前后沙棘果油的脂肪酸组成Table 4 Fatty acid composition of SPO before and after molecular distillation

3 结 论

本研究从工厂采集的沙棘果毛油中检测出了7 种PAEs组分，其中DBP、DEHP含量分别为1.626、10.933 mg/kg，分别超出GB 9685—2016限量4.42 倍和6.29 倍，说明所取样品可能受到塑化剂污染。对这种高塑化剂含量的油脂采用200 ℃、真空度0.1 Pa、物料流速50 滴/min、刮膜转速190 r/min的条件进行PAEs两级分子蒸馏脱除，一级分子蒸馏后DBP残留量为0.071 mg/kg，已明显低于GB 9685—2016限量；经两级分子蒸馏，DEHP残留量为0.668 mg/kg，也明显低于GB 9685—2016限量。结果表明，两级分子蒸馏技术能有效脱除沙棘果油中高含量的PAEs，且其脂肪酸组成没有明显变化，不会产生反式脂肪酸，同时能够达到脱除部分脂肪酸的效果，但会造成沙棘果油中VE、甾醇、黄酮类等活性成分较严重的损失。因此，应视油脂中DBP和DEHP的超标程度合理选用一级分子蒸馏或两级分子蒸馏，在保证DBP和DEHP脱除达到国标限量的同时尽量减少VE等活性成分损失。本研究结果明确了对塑化剂超标率很高的食用植物油中塑化剂的精准脱除工艺技术，对油脂精准加工技术的发展及食用植物油安全品质的提升具有重要意义。