二维薄层色谱法分析分枝杆菌脂质成分

石耀林,王丙云,毕利军,陈 鑫,黄雯晶,陈 勇

(佛山科学技术学院生物科学与工程学院,广东 佛山 528225)

牛结核病(Bovine Tuberculosis)是由牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患慢性传染病,我国将其列为二类动物疫病,接种疫苗是控制牛结核病的手段之一,目前为止卡介苗(BCG)是临床上唯一应用的抗牛结核病疫苗,但BCG的疫苗效果不均一性的问题引起研究者关注,因此寻找新型有效的疫苗尤为重要[1-3]。

现阶段新型牛结核病疫苗较多研究重组BCG疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗和蛋白亚单位疫苗,而对分枝杆菌脂质成分疫苗的研究尚不多,随着耐多药结核(MDR)及广泛耐药结核(XDR)的发现,所以需要研发具有更安全有效的保护作用的新型牛结核疫苗应用于临床。结核菌是一种细胞壁富集脂类的细菌,其抗原性参与到结核免疫应答,这里我们利用有机溶剂萃取结核菌细胞壁脂类[4],并通过薄层色谱法[5]探讨BCG和耻垢分枝杆菌细胞壁脂类成分差异,从而为研发新型牛结核疫苗提供新的方向,为分枝杆菌脂质成分疫苗研究提供可能[6]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 BCG-pasteur菌株(实验室保存);mc2155菌株(实验室保存)。

1.1.2 仪器 薄层色谱展开缸(100 mm×200 mm),购自上海信谊仪器有限公司;层析板(100 mm×200 mm),购自青岛海洋有限公司。

1.1.3 主要试剂 石油醚,氯仿,甲醇,丙酮,均为分析纯试剂购,自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.4 培养基 Middbrook7H9液体培养基、Middbrook7H10固体培养基、增菌液OADC,均购自美国BD公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种制备 将BCG-pasteur和mc2155菌株分别接种50 mL Middbrook7H9培养基,BCG-pasteur菌株培养1周,而 mc2155菌株培养到0.8～1.0OD后收集菌液,121℃灭活20 min,4 000 r/min离心10 min后弃上清,用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)洗2次,收集菌体。

1.2.2 脂质的萃取 旋转蒸发烘干菌体,称取100 mg干重的菌体[7]。先加入2 mL甲醇：0.3%NaCl(100∶10)溶液和1 mL石油醚到离心管,混匀20 min。3 500 r/min离心5 min后将上层液体移去新的离心管A,接着再加入1 mL石油醚再次混匀20 min萃取。再将上层液体移去离心管A,两次上层液体合并,用氮气干燥,析出非极性脂质[8]。

1.2.3 二维薄层色谱法 左下角离板1 cm x 1 cm的距离涂点等量的脂质,标记方向1与方向2,风机下干燥样品[9]。根据溶剂体系加入展开剂(如表1所示),按照方向1摆放底部,当溶剂的前端渗透薄层板顶部,拿出风干薄层板;加入新的展开剂换方向2[10],溶剂渗透顶部拿出风干,用5%乙醇磷钼酸染色,100℃烧灼薄层板15 min,扫描仪下扫描薄层。

1.2.4 图片阴影相对值采用Imagej工具计算,脂质阴影值用Mean表示。展开剂系统A-D见表1。

表1 2D-TLC分析脂质的展开剂系统

2 结果与分析

2.1 2 D-TLC展开剂系统A分析比较 展开剂系统A下,可分离出三酰甘油和甲硫酚二角酰亚胺两种脂质成分,经分析,BCG-pasteur中三酰甘油TAG的Mean值为72.724,甲硫酚二角酰亚胺PDIM的Mean值为55.991;mc2155中三酰甘油TAG的Mean值为50.176,甲硫酚二角酰亚胺PDIM的Mean值为49.594,含量均比BCG-pasteur的低。见图1。

2.2 2 D-TLC展开剂系统B分析比较 展开剂系统B下,可分离出家族蛋白PAT、甘油二酯、游离脂肪酸和游离分枝菌酸,经分析,BCG-pasteur中家族蛋白PAT的Mean值为36.79,甘油二酯DAG的Mean值为76.293;mc2155中家族蛋白PAT的Mean值为29.736,甘油二酯DAG的Mean值为25.142,含量均比BCG-pasteur的低。见图2。

图1 展开剂系统A下BCG-pasteur与mc2155菌株脂质成分以及含量比较

图2 展开剂系统B下BCG-pasteur与mc2155菌株脂质成分以及含量比较

2.3 2 D-TLC展开剂系统C分析比较 展开剂系统C下,可更细分出游离脂肪酸与游离分枝菌酸,经分析,BCG-pasteur中游离脂肪酸 FREE FATTY ACID的Mean值为86.676,游离分枝菌酸 FREE MYCOLIC ACID的Mean值为83.11;mc2155中游离脂肪酸FREE FATTY ACID的Mean值为15.445,游离分枝菌酸 FREE MYCOLIC ACID的Mean值为64.645,含量均比BCG-pasteur的低。展开剂系统C展开下的脂质含量与系统B的相对应,因此该萃取方法以及展开剂系统具有重复性。见图3。

图3 展开剂系统C下BCG-pasteur与mc2155菌株脂质成分以及含量比较

2.4 2 D-TLC展开剂系统D分析比较 展开剂系统D下,可分离出硫脂I类、硫脂III类和葡萄糖单霉菌酸酯,薄层色谱法结果显示mc2155不含有硫脂I类。Imagej计算得出 BCG-pasteur中硫脂 III类SL-III的Mean值为19.281,海藻糖二霉菌酸酯TDM的Mean值为60.371;mc2155中硫脂III类SL-III的Mean值为5.118,海藻糖二霉菌酸酯TDM的Mean值为4.314,含量均比BCG-pasteur的低。见图4。

图4 展开剂系统D下BCG-pasteur与mc2155菌株脂质成分以及含量比较

3 讨论

本试验主要是为了研究结核分枝杆菌的脂质成分的不同,为新型牛结核疫苗和佐剂的研发提供基础,由于脂质成分不溶于水但能被乙醚、石油醚、氯仿、苯等有机溶剂抽提出,本研究中根据其特性萃取方法进行了优化,其中乙醚溶解脂肪的能力强,应用最多,但现在对于乙醚安全管制严格,而石油醚溶解脂肪的能力仅比乙醚弱些,且来源方便,且含水分比乙醚少,没有乙醚易燃故在萃取脂质方法中将选取石油醚有机溶剂作为萃取试剂,同时,石油醚在研究用途上主要用作溶剂和油脂处理,石油醚本身属于无色透明液体,在萃取离心后,能有效分层,提高分辨率[11]。

二维薄层色谱法操作是首先在一个方向将混合物进行色谱分离,将纸干燥后,再将混合物用另一种溶剂在与第一个方向的垂直方向进行第二次色谱分离,使用不同溶剂进行双向展开,相对于单向薄层色谱,二维薄层色谱法的分离效率大大提高,且重复性更稳定[12]。由于TAG与PDIM极性较小,故展开剂系统A选用石油醚∶乙酸乙酯系统和石油醚∶丙酮系统;同理,在系统B中DAG等脂质的极性相对较小,故展开剂也使用石油醚∶丙酮系统;而游离脂肪酸与游离分枝菌酸极性较前两系统的大,为了更有效的展开成分,故在第一个方向的展开剂的选择上选取氯仿∶甲醇系统;另外,由于两次展开都在同一块薄层板上进行,倘若第一维展开剂中含水,则干燥过程将十分耗时,且很难控制薄层板的含水量,故建议将含水较多的展开剂放在第二维,以确保方法的重现性,因此在展开剂系统D中含水量较多的氯仿：丙酮∶甲醇∶水系统将放在第二维。

本试验通过建立的萃取方法分离了分枝杆菌的非极性脂质以及通过二维薄层色谱法分析脂质成分,其中可能包括为三酰甘油(Triacylglycerols,TAG)、甲硫酚二角酰亚胺(Phthiocerol dimycocerosates,PDIM)、家族蛋白PAT(Perilipin adipophilinTIP47)、甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)、游离脂肪酸(FREE FATTY ACID,FFA)、游离分枝菌酸(FREE MYCOLIC ACID,FMA)、硫脂 I类(Sulphatides-I,SL-I)、硫脂 III类(Sulphatides-III,SL-III)、葡萄糖单霉菌酸酯(Glucose esters single mold,GMM)、海藻糖二霉菌酸酯(Trehalose esters double mold,TDM)。

根据BCG-pasteur以及mc2155薄层色谱法结果,本试验建立的萃取方法以及展开剂系统具有可重复性,能准确萃取以及分析分枝杆菌中的非极性脂质成分,研究结果显示,mc2155细菌中含有脂质成分占比明显低于BCG-pasteur的细胞壁脂质成分。耻垢分枝杆菌属革兰阳性腐生菌,具有快速生长特点,且无致病性,有研究表明,耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌基因高度同源、细胞结构相似等特点[13],这由于两者的基因虽高度同源,但其仍具有差异之处,这在一定程度上影响了各脂质部分的含量以及组成,另外研究发现,细胞壁脂类与潜在的结核病的发病机制和宿主防御过程具有关联性,而两者脂质成分的差异以及含量不同与此观点相呼应[14]。本试验结果可见不同分枝杆菌脂类存在较大的差异,通过我们的试验可以找到具有保护作用的脂质成分,能够以耻垢分枝杆菌为疫苗载体表达其结核分枝杆菌或者卡介苗中抗原特异性脂类成分,从而提高其免疫原性,可能为一种新的牛结核疫苗研究提供思路,同时这些差异较大的脂质成分也可以作为新的免疫佐剂用以提高卡介苗的免疫保护效果。