山梨醇代谢旁路及其在生殖领域研究进展

李玲君，张月鑫，崔毓桂

山梨醇，又名D-葡萄糖醇，是一种六碳多元醇，天然存在于苹果、梨、桃、杏和一些蔬菜中，具有很高的吸湿性，可防止水分流失，常用于糖果产品中[1]。细胞内的山梨醇代谢旁路，又称多元醇代谢旁路，是葡萄糖代谢的通路之一，即葡萄糖在醛糖还原酶（AR）催化下生成山梨醇，再经过山梨醇脱氢酶（SORD）作用转化为果糖[2]。生理条件下该通路是葡萄糖代谢的补偿通路而处于低水平激活状态；在高血糖等病理生理学过程中，细胞内这条通路被异常激活参与葡萄糖代谢，导致山梨醇、果糖积累，糖基化终产物（AGE）形成，细胞内的氧化-还原失衡、活性氧簇（ROS）升高，与多种疾病密切相关[3]。研究发现，山梨醇旁路被异常激活是糖尿病并发症的发病机制之一，通过某种方式抑制该旁路是有潜在前景的预防或控制糖尿病慢性并发症的手段[2]。近年研究发现，山梨醇代谢旁路在生殖系统中具有某些作用，尽管目前尚未明确，例如睾丸、附睾及其他附性腺均表达AR和SORD，提示山梨醇旁路可能的作用[4-5]；山梨醇旁路还与卵母细胞成熟有关，在卵母细胞体外成熟（IVM）培养液中添加高浓度山梨醇对卵母细胞成熟产生负面影响[6-8]。本文介绍细胞内山梨醇代谢旁路及其在生殖领域的研究进展。

1 细胞内山梨醇代谢旁路

组织细胞内葡萄糖代谢的山梨醇代谢旁路，是由两种酶催化的两步反应（见图1），葡萄糖首先在AR的催化下生成山梨醇，同时将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）转化成为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）；第二步山梨醇在SORD的催化下生成果糖，同时将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）转变为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。

图1细胞内葡萄糖代谢的山梨醇旁路

1.1 AR AR为山梨醇代谢旁路的限速酶，属于醛-酮还原酶超家族的一员，是一种以胞浆NADPH为辅酶的氧化还原酶[9-10]。人类AR由315个氨基酸残基构成，呈β/α三维桶状结构，催化活性中心位于桶芯，NADPH辅助因子连接在β/α桶的羧基（—COOH）末端的顶端[9-10]。由于AR与葡萄糖的亲和力很低，在血糖正常时细胞内葡萄糖大多经由糖酵解途径代谢；山梨醇代谢旁路作为葡萄糖代谢的一条补偿通路而处于低水平状态，生理条件下该旁路代谢的葡萄糖极少[11]。当血糖增高时，己糖激酶饱和，会刺激AR生成和酶活化，激活山梨醇代谢旁路，增加了葡萄糖通过该旁路的代谢[11]。

葡萄糖并不是AR唯一底物，其他底物还包括异己醛、4-羟基-反式-2-壬醛（4HNE）和4HNE谷胱甘肽加合物（GS-HNE）等[12-13]。异己醛是类固醇激素合成第一步胆固醇氧化分解侧链断裂生成的产物之一，人、狗、兔、猴肾上腺内的异己醛主要通过AR代谢[12]。4HNE为脂质过氧化主要的终产物之一，细胞内高浓度4HNE可通过c-Jun氨基末端激酶（JNK）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）等多种途径诱导细胞凋亡信号传导，GS-HNE是其代谢的一种中间形式[14]。细胞内ROS升高导致脂质过氧化增加，4HNE升高，4HNE的积累诱发细胞内凋亡信号，AR与4HNE反应后可降低4HNE和GS-HNE的细胞毒性[13-14]。

AR还原葡萄糖同时消耗NADPH。NADPH是还原型谷胱甘肽（GSH）的再生辅助因子，而GSH是体内重要的抗氧化剂，NADPH降低会导致GSH消耗进而加剧细胞内的氧化应激[3]。

1.2 SORD SORD催化山梨醇转化为果糖。SORD属于中链脱氢酶/还原酶蛋白家族。人类SORD为四聚体，每个亚基由356个氨基酸残基和一个锌原子组成，形成两个β桶状结构，两者之间有缝隙，而催化活性中心位于缝隙的底部[15]。SORD的辅酶结合域是经典的罗斯曼（Rossmann）折叠，可逆性结合辅助因子NAD+[15]。SORD催化山梨醇2号位碳上的氢对NAD+烟酰胺的4号位碳亲核取代，将山梨醇转变成果糖并生成NADH[16]。除D-山梨醇外，SORD底物还包括L-艾杜醇、D-木糖醇和D-半乳糖醇等[17]。

SORD将山梨醇转变为果糖的同时，使细胞内NADH积累。线粒体呼吸链复合物Ⅰ催化2个电子从NADH转移到醌池，并将质子从线粒体内泵入膜间隙产生质子梯度，为ATP生成做准备。当NADH过高时，线粒体呼吸链复合物Ⅰ不断将其氧化为NAD+，导致复合物Ⅰ过载，形成更多超氧化物[18]。另有研究发现，在大鼠肝脏和肌肉线粒体内高膜电位的条件下，ROS和NADH同步改变，NADH积累、NAD+/NADH比值下降促进ROS生成[19]。

总之，SORD催化山梨醇转变为果糖的同时，NADH积累，ROS生成增多，导致细胞内氧化-还原失衡，氧化应激增加。

2 山梨醇代谢旁路与相关疾病

山梨醇代谢旁路与多种疾病有关，研究最多的是其与糖尿病并发症间的联系[20-22]。

2.1 糖尿病及其并发症 在高血糖状态下，细胞内30%的葡萄糖通过山梨醇代谢旁路被代谢，该旁路的激活使NADPH减少，NAD+/NADH比值降低，导致细胞内氧化-还原失衡。同时，反应生成的山梨醇和果糖积累，导致细胞内渗透压升高，细胞功能受损[3]。果糖及其代谢产物3-磷酸果糖和3-脱氧葡萄糖是比葡萄糖更有效的非酶糖化剂，AGE与其受体结合也引起氧化应激[23]。以上均为糖尿病慢性并发症的发病机制，如在糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病等微血管并发症的发生发展过程中，ROS的增高、山梨醇积累、AGE形成，通过氧化应激机制激活蛋白激酶C（PKC），诱导细胞因子、趋化因子以及不同的炎症和凋亡信号，破坏微血管，引发糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病[20-21]。

研究糖尿病神经病变的发病机制，发现施旺细胞内山梨醇代谢旁路高激活，山梨醇和果糖浓度增加，细胞内渗透压升高，促进细胞内电解质流出，影响细胞功能。细胞内山梨醇和果糖积累，还降低肌醇和牛磺酸浓度，因此抑制Na+-K+泵，使细胞内Na+积累导致轴突和轴索肿胀，神经胶质功能障碍和神经传导速度（NCV）降低。此外，AR消耗NADPH和GSH；SORD使细胞内NADH积累、NAD+/NADH比值减小，导致血管内皮神经损伤及NO介导的血管舒张功能丧失；该通路还使神经、脊髓和背根神经节的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性升调节，在糖尿病神经病变中起着重要作用[22]。

有研究显示，阿尔茨海默病脑区的山梨醇和果糖浓度显著升高，提示山梨醇代谢旁路被激活，可能与阿尔兹海默病神经病变有关[24]。今后需要更多研究探讨山梨醇代谢旁路在其发生发展中的作用。

2.2 缺血/再灌注（I/R）损伤 研究显示，山梨醇代谢旁路在I/R损伤中起负面效应。脂肪肝小鼠模型的肝脏I/R处理，与对照组相比，腹腔注射AR抑制剂后能减少I/R引起的NADPH损失、改善氧化-还原失衡、显著增强B淋巴细胞瘤2（bcl-2）和其与Bcl-2相关X蛋白比值（bcl-2/bax）、抑制caspase-3活化、提高GSH胞浆含量、降低丙二醛（MDA），因此明显减低I/R损伤。人L02肝细胞系高表达AR后再采取缺氧/复氧（H/R）的处理，与未诱导AR高表达的对照组相比，细胞内MDA增多，肝细胞膜受损程度增高，线粒体膜电位水平被破坏，细胞凋亡增加。提示山梨醇代谢旁路会增加肝细胞对I/R事件的敏感性，小分子AR抑制剂则通过抑制山梨醇代谢旁路可能成为脂肪肝缺血/再灌注损伤中保护肝脏的有效辅助方法[25]。

正常小鼠肝脏I/R处理同时应用SORD抑制剂，能显著减轻I/R引起的肝脏组织学改变和肝细胞损伤。抑制SORD活性，逆转了I/R引起的NAD+/NADH失衡，降低I/R诱导的ROS和氧化应激，抑制肝细胞Caspase-3激活；同时，糖酵解途径关键酶3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）发挥催化反应依赖NAD+同步还原为NADH，应用SORD抑制剂有益于恢复NAD+/NADH的平衡，使葡萄糖更多地从糖酵解途径代谢，增加ATP生成，逆转I/R引起的能量亏损。故SORD抑制剂和AR抑制剂一样也可能成为保护肝缺血/再灌注组织损伤的辅助方法[26]。

心肌细胞I/R早期，AR活性升高、山梨醇代谢旁路高激活，可通过抑制β-连环蛋白（β-catenin）急性激活抑制内皮-间充质转换（EndMT），从而抑制心肌修复[27]。

2.3 肿瘤发生及侵袭性 在人结直肠腺瘤和结直肠癌细胞系，AR表达降低，SORD表达上调，提示山梨醇代谢旁路可能与肿瘤发生过程的细胞代谢重构有关[28]。目前尚缺乏细致的作用及机制研究。在NCL-60癌细胞系中基因阵列分析显示，AR与上皮细胞-间充质转换（EMT）主要调节锌指转录因子1（ZEB1）密切相关；乳腺癌细胞系和肺癌细胞系在ZEB1敲除后AR也显著减低。肺癌细胞系和卵巢癌细胞系抑制AR表达后，EMT及肿瘤生长均受到抑制，敲低SORD出现类似结果；高浓度葡萄糖致多元醇代谢旁路异常激活，后者刺激转化生长因子β（TGF-β）相关信号通路，促进肺癌细胞系EMT[29]。

3 山梨醇代谢旁路与雄性生殖

在生殖系统，山梨醇代谢旁路也起重要作用。研究发现，大鼠睾丸支持细胞高表达AR，生精细胞不表达；生精细胞表达SORD，支持细胞不表达[4]。肾上腺中的AR能代谢胆固醇侧链裂解副产物异己醛[12]，而睾丸精子发生过程中精子胞质和脂质膜的丢失过程需要处理胆固醇，故推测支持细胞高表达AR，主要功能是处理异己醛、脂醛等胆固醇代谢的副产物。

猪附睾液的葡萄糖、果糖不断变化，在附睾头较高、在附睾尾较低，而山梨醇浓度在附睾管中相对稳定。附睾尾部低葡萄糖、果糖，可能是由于储存于附睾的精子利用葡萄糖和果糖作为能量物质而代谢所致；山梨醇在附睾管不同区段相对均匀分布，提示其可能参与维持附睾液渗透压以维持精子头部形态，而不是能量物质[30]。

另有研究发现，牛的附睾上皮细胞高表达AR、SORD，且附睾头、体、尾AR和SORD的表达及活性存在差异，AR蛋白及酶活性在附睾尾部较低（相对于头、体部），SORD蛋白和酶活性在附睾尾较高（相对于头、体部），这有利于山梨醇向果糖转化，而果糖更易于进入糖酵解产生能量，其为储存在附睾尾的精子提供能量[31]。

不完全等同于牛的研究，人附睾头、体、尾均表达AR和SORD，且在各区段相对均匀，主要出现于附睾上皮细胞的顶端。这种差异可能是人类附睾独特的形态学特点所致，与牛相比，人类附睾尾发育不良，精子储存能力低下，故附睾中山梨醇旁路可能发挥其他作用[5]。

山梨醇和果糖是人类、猪、大鼠、公羊精液的组成成分，为精子活动的能量来源之一[5,30]。人附睾小体和前列腺小体内有AR和SORD表达，在牛附睾小体内，AR为主要酶之一[5,31]。还有研究发现，大鼠精子从附睾头向尾运行时，附睾上皮细胞的AR会通过附睾小体转移到精子上，这种“传递”具体作用尚不清楚，可能与精子活动有关[4]。

综上，山梨醇代谢旁路可能参与精子发生过程和成熟过程：①支持细胞AR可能参与代谢与清除精子发生过程中胆固醇侧链裂解所产生的有毒醛类；②附睾内葡萄糖、山梨醇、果糖可能参与精子成熟和储存，精液中山梨醇、果糖也是精子能量来源之一；③附睾小体、前列腺小体介导附性腺与精子之间的AR、SORD运输，这种“传递”可能与精子活动有关。

4 山梨醇代谢旁路与雌性生殖

卵母细胞成熟过程有4种糖代谢的方式：糖酵解、磷酸戊糖途径、己糖胺生物合成途径和山梨醇代谢旁路[11]。有研究发现，卵母细胞和颗粒细胞均有AR和SORD的表达，且卵母细胞通常高表达AR和SORD，表明山梨醇代谢旁路在卵母细胞发育与成熟中有某种重要作用[32]。

卵母细胞减数分裂恢复由中期促进因子（MPF）触发[33]。卵母细胞MPF是由一个催化亚基和一个调节亚基组成的蛋白复合物，前者是细胞周期蛋白依赖的激酶1（Cdk 1），后者是细胞周期蛋白B1（cyclin B1）。卵泡刺激素（FSH）与颗粒细胞上的FSH受体结合，使卵母细胞内环磷酸腺苷（cAMP）含量激增，调控卵母细胞MPF的活性，对于恢复卵母细胞减数分裂很关键[34]。有研究发现，糖尿病小鼠中FSH不能有效刺激卵母细胞成熟[35]。那么，糖尿病小鼠卵母细胞对FSH低反应性是否是由于山梨醇代谢旁路异常激活？有学者将正常小鼠和糖尿病小鼠的卵丘-卵母细胞复合物（COC）分别在含FSH的培养基中培养，同时添加不同浓度的山梨醇，比较生发泡破裂（GVBD）发生率，结果表明山梨醇以剂量依赖的方式抑制FSH诱导的减数分裂和卵母细胞成熟；正常小鼠和糖尿病小鼠的COC在含FSH的培养基中培养，不添加外源性山梨醇，各自分别添加了AR抑制剂和AR激动剂，结果表明抑制AR后糖尿病小鼠COC被抑制的GVBD发生率得到改善，添加AR激动剂后正常小鼠COC的FSH促进GVBD作用被抑制，同时降低cAMP产生。提示了山梨醇代谢旁路对激素诱导的卵母细胞减数分裂具有抑制作用，因为山梨醇减少了FSH诱导的cAMP生成[6]。

奶牛子宫液含较高的山梨醇，低水平山梨醇可导致奶牛不孕[32]。研究发现，牛和大鼠的输卵管局部存在差异表达的AR和SORD，作用尚不明确，可能与配子储存、精子获能并完成受精、早期胚胎发育等事件有关[36]。

Lin等[7]研究了山梨醇对猪早期胚胎发育的影响，在体外培养液中添加不同浓度的山梨醇，观察其对猪卵母细胞成熟和囊胚形成的影响，并分析卵母细胞内ROS和GSH含量，发现在添加较高浓度的山梨醇时，卵母细胞内ROS增高，卵母细胞成熟率、卵丘细胞扩张均降低，囊胚形成率显著降低，胚胎的细胞凋亡指数增加，说明较高浓度的山梨醇对卵母细胞质量和早期胚胎发育均有负面影响。Yamauchi等[8]发现，IVM培养液添加一定浓度山梨醇升高培养液的渗透压，卵母细胞GVBD发生率降低，卵母细胞成熟减少。

因此，IVM培养液添加外源性山梨醇，可能通过三个方面影响卵母细胞成熟：①减少FSH诱导cAMP增高和新嘌呤合成；②减少GSH，增加卵母细胞ROS和氧化应激；③升高了IVM培养液的渗透压。

5 总结和展望

山梨醇代谢旁路的异常激活，与糖尿病慢性并发症密切相关，已合成多种小分子AR抑制剂以对应不同的糖尿病并发症，如针对糖尿病眼病的索比尼尔（sorbinil）、针对糖尿病神经病变的槲皮素（quercetin）等，抑制高血糖所致山梨醇代谢旁路异常激活，有望进入临床用于预防和治疗糖尿病慢性并发症[10]。近年研究发现，山梨醇代谢旁路在生殖系统也发挥重要作用，人和公羊、牛、猪等动物精液中山梨醇和果糖可作为精子活动的能量来源物质，睾丸支持细胞AR参与清除精子发生过程的有毒代谢产物。在雌（女）性，山梨醇代谢旁路与卵母细胞成熟有关，在IVM培养液中添加较大浓度山梨醇对卵母细胞成熟产生负面影响，可能与减少FSH诱导的cAMP生成、提高卵母细胞内ROS、升高培养液渗透压等有关。研究山梨醇代谢旁路在生殖系统的作用，对于进一步阐明配子发生与成熟、提高IVM培养液效能具有重要意义。