紫外指纹图谱结合化学计量学对洞庭碧螺春的鉴别分析

张 丽，张文韬，刘文静，刘腾飞，董明辉，郁志芳*

(1.苏州市职业大学 教育与人文学院，江苏 苏州 215104；2.苏州市吴中区果蔬园艺站，江苏 苏州 215107；3.南京农业大学 食品科技学院，江苏 南京 210095；4.苏州市农业科学院 农产品加工与质量安全研究室，江苏 苏州 215155)

碧螺春茶作为我国十大名茶之一，自古以来就受到了人们的广泛关注和喜爱。碧螺春茶所含的茶多酚、儿茶素、氨基酸等含量较高，而且味道鲜浓、口感醇厚[1-2]。但是，随着碧螺春产业的不断发展与扩大，当前洞庭碧螺春茶出现了产品品质参差不齐、假冒伪劣产品泛滥等诸多问题，严重影响了碧螺春茶产业的可持续发展[3]。因此，有必要对碧螺春茶进行质量评价和真伪鉴别，进而保护名优茶的独特品质[4-5]。

化学指纹图谱是以化学成分为基础进行的光谱或者色谱研究，通过测定样品中的多种特征化学成分并以此鉴定和获得化学成分稳定性的特性图谱，通过样品的整体化学信息特征来控制其质量，是一种综合、可量化的、可对成分复杂物质进行质量控制的方法[6-7]。目前应用指纹图谱技术对中药质量和产地鉴别的研究已经非常广泛[8]。然而，在洞庭碧螺春茶的质量等级和产地鉴别中应用指纹图谱技术的报道较少，陈波等[9]选择 9 000～4 000 cm-1的近红外光谱对不同等级的碧螺春茶叶进行扫描，结果表明不同等级的碧螺春可以通过近红外光谱分析进行分类。刘臣等[10]以咖啡碱为参照物建立了苏州洞庭碧螺春茶的高效液相指纹图谱，但是上述两种仪器设备使用成本较高，不适宜实际生产中的推广应用，相对而言，紫外指纹图谱能解释样品的整体信息，且成本较低，效率较高。

本研究主要以苏州洞庭东山和西山的碧螺春茶为原料，通过紫外光谱技术结合化学计量学构建洞庭碧螺春茶的紫外指纹图谱，并利用主成分分析和偏最小二乘判别分析对洞庭东、西山的碧螺春茶进行鉴别研究，以期为洞庭碧螺春茶的鉴别分析和等级评定提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1) 采用各等级碧螺春春茶作为试验样品。样品均来自苏州市吴中区洞庭东山的6个厂家以及洞庭西山的4个厂家，且包含特级一等、特级二等、一级、二级、三级等5个等级，按照洞庭碧螺春茶感官指标的国家标准对厂家的各等级茶样进行严格挑选，所有茶样均采用自封袋进行独立密封包装，并将其存放于-20 ℃冰箱中。将洞庭东山6个厂家的样品依次标记为A、B、C、D、E、F，洞庭西山4个厂家的样品依次标记为G、H、I、J，此外，碧螺春茶的5个等级依次标记为T1、T2、1、2、3。

2) 试验试剂主要为甲醇、丙酮、氯仿和无水乙醇等试剂，均为分析纯。

3) 试验主要设备为电子天平(SQP，赛多利斯科学仪器有限公司)；高速万能粉碎机(FW100，天津市泰斯特仪器有限公司)；数控超声波清洗器(KQ-300DB，昆山市超声仪器有限公司)；紫外-可见分光光度计(UV-1800，日本岛津公司)。

1.2 试验方法

1) 样品处理：将购买的碧螺春茶样品用高速万能粉碎机粉碎后，过60目筛，放于自封袋中备用。准确称取样品0.300 0 g，置于25 mL具塞刻度试管中，加入95%甲醇20 mL，将试管进行密塞，超声提取40 min后过滤得到其滤液，取1 mL滤液置于100 mL容量瓶中并用95%甲醇定容，摇匀待测。

2) 测试条件：将待测的提取液用UV-1800紫外可见分光光度计以相应溶剂调整基线，并作为参比溶液进行紫外光谱扫描，设定扫描波长范围为190～400 nm，狭缝为1 nm，采样间隔为0.2 nm，每个样品重复测定3次。

3) 提取溶剂优化：以AT2样品为考察对象，准确称取0.300 0 g样品3份，置于25 mL具塞刻度试管中，分别加入超纯水、95%甲醇、95%乙醇、95%丙酮、氯仿各20 mL，超声提取50 min后过滤得到其滤液，并将各滤液分别稀释10、25、50、100倍之后进行紫外光谱扫描测定。

4) 超声时间优化。以AT2样品为考察对象，准确称取0.300 0 g样品3份，置于25 mL具塞刻度试管中，加入95%甲醇20 mL后密塞，分别超声提取20 min、30 min、40 min、50 min后过滤得到其滤液，取1 mL滤液置于100 mL容量瓶中并用95%甲醇定容，摇匀后进行紫外光谱扫描测定。

5) 精密度试验：以AT2样品为考察对象，采用上述样品处理方法和测试条件进行紫外光谱扫描，重复测定7次，计算吸收波长的平均相对标准偏差RSD，考察精密度[13]。

6) 重复性试验：以AT2样品为考察对象，采用上述样品处理方法处理样品，分别称取7份，以上述测试条件进行紫外光谱扫描，计算吸收波长的平均相对标准偏差RSD，考察重复性[13]。

7) 稳定性试验：以AT2样品为考察对象，经本研究的试验方法处理的样品，分别在0、2、4、6、8、10、24 h处理，以本研究的测试条件进行紫外光谱扫描，计算吸收波长的平均相对标准偏差RSD，考察稳定性。

2 结果与分析

2.1 最佳提取溶剂

洞庭碧螺春茶样品分别用超纯水、95%甲醇、95%乙醇、95%丙酮、氯仿等溶剂进行提取后，由紫外光谱图可知，以95%甲醇为提取剂的色谱吸收峰数目最多，表明洞庭碧螺春茶化学成分被提取的最充分。而且当滤液稀释100倍时特征峰明显，有利于对不同碧螺春茶样品进行区分，因此，选择95%甲醇作为最佳提取溶剂，并将滤液稀释100倍后进行紫外光谱扫描。

2.2 最佳提取时间

碧螺春茶样品超声提取时间分别为20 min、30 min、40 min、50 min后，超声结果表明，当以95%甲醇为提取剂的超声时间为20 min时，吸收峰数目最少；30 min次之；当超声40 min和50 min时，吸收峰数目变化不大。因此，选择最佳提取时间为40 min。

2.3 方法学考察

50个洞庭碧螺春茶样品分别用超纯水、95%甲醇、95%乙醇、95%丙酮、氯仿等溶剂进行提取后，以95%甲醇为提取溶剂所得到的紫外光谱的精密度、重复性、稳定性的RSD均为1%以下，表明该方法稳定可靠。

2.4 碧螺春茶紫外指纹图谱分析

紫外指纹图谱是由于不同物质体系化学成分含量和不饱和程度的差异，导致峰形、峰高、峰面积等具有差异，因而可通过对不同物质体系的紫外指纹图谱进行鉴别分析。50个碧螺春茶的紫外指纹图谱叠加后如图1所示。由图1可知，不同产地、不同等级碧螺春茶之间原始图谱的出峰位置和峰形相似，但吸光度大小均具有差异。结果表明，各碧螺春茶样品之间的主要化学成分组成相似，但含量存在差异，具有指纹特性。

图1 洞庭碧螺春茶紫外指纹图谱

图2 洞庭东山碧螺春茶紫外指纹图谱

图3 洞庭西山碧螺春茶紫外指纹图谱

来自洞庭东山和西山的碧螺春茶紫外指纹图谱叠加如图2和图3所示。由此可知，相同产地不同厂家不同等级碧螺春茶之间的共有峰在紫外光谱图的特征区(200～300 nm)中峰形相似，峰高存在差异。对比图2和图3可知，洞庭东山和西山碧螺春茶的紫外指纹图谱主要共有峰的吸收波长分布在203 nm、210 nm、265 nm、270 nm附近。紫外指纹图谱之间峰高存在差异，洞庭东山产区第一个波峰的最大吸收值为2.513，最小吸收值为0.896；第二个波峰的最大吸收值为0.680，最小吸收值为0.143。洞庭西山产区第一个波峰的最大吸收值为2.027，最小吸收值为0.767；第二个波峰的最大吸收值为0.418，最小吸收值为0.119。

结果表明：不同产区，不同等级碧螺春茶之间的主要化学组成成分相似，但主要成分含量之间存在差异，洞庭西山的化学成分含量低于东山碧螺春茶，碧螺春茶的主要化学成分含量存在个体差异和产地之间的差异。

3 数据处理

将所测50个碧螺春茶样品的原始紫外指纹图谱数据导入UV-Probe 2.43中进行一阶求导的处理，然后分别将原始数据和一阶求导后的数据导入SIMCA-P 14.0软件进行单位方差换算(unit variance scaling)后，再进行主成分分析以及偏最小二乘判别分析。

3.1 主成分分析

主成分分析法(PCA)是一种将原来反映样品信息的多个变量进行整合，压缩成少数几个综合变量，可以用二维图直观反映样品信息的统计分析方法[11，14]。同时，它也是一种非监督模式识别方法[15]。将碧螺春茶样品的原始紫外光谱数据和一阶求导数据导入SIMCA-P 14.0软件中，经过单位方差换算处理后，进行主成分分析，用以区分碧螺春茶的不同产地和不同等级。

3.1.1 原始数据PCA

碧螺春茶的原始紫外指纹图谱数据进行主成分分析后的二维得分分布如图4所示。由图4可知，第一主成分和第二主成分的累计贡献率为95.9%，各碧螺春茶样品之间的关系可以在PCA得分图中直观地显示出来。

1) 从洞庭东山和西山的碧螺春茶在PCA得分图中可以看出，产地为洞庭西山的 G、H、J等3个厂家的碧螺春茶与洞庭东山的A、B、C、D、E、F等6个厂家的大部分样品之间距离较远。由此可以表明，不同产地碧螺春茶之间的地域差异明显，紫外指纹图谱对于不同产地之间的碧螺春茶可以较好地进行区分。

图4 洞庭碧螺春茶原始数据PCA主成分分析

2) 从不同厂家的碧螺春茶在得分图中可以看出，G厂家中除G2外，其他4个等级碧螺春茶聚到一起，H厂家的5个等级茶样聚到一起，表明G厂家和H厂家不同等级碧螺春茶之间具有很大的相似性，没有进行很好的区分，因而聚到一起。并且除AT1、CT1、DT1、ET1外，AT2、BT1、BT2、CT2、DT2、ET2、FT1、FT2等6个厂家中的特级碧螺春茶距离较近，且分别与各自厂家的非特级碧螺春茶之间距离较远，表明洞庭东山的碧螺春特级茶和非特级茶之间差异明显，可以较好地对其进行区分。

图5 洞庭碧螺春茶一阶求导数据PCA主成分分析

3.1.2 一阶求导数据PCA

碧螺春茶的一阶求导数据进行主成分分析后的二维得分分布如图5所示。由图5可知，第一主成分和第二主成分的累计贡献率为70.5%，各碧螺春茶样品之间的关系可以在PCA得分图中直观地显示出来。

1) 洞庭东山和西山的碧螺春茶在PCA得分图中，产地为洞庭西山的G、H、J等3个厂家的碧螺春茶与洞庭东山的A、B、C、D等4个厂家的大部分样品之间距离较远。一阶求导数据的结果虽与原始数据结果不完全等同，但也可以表明，不同产地碧螺春茶之间的地域差异明显，紫外指纹图谱对于不同产地之间的碧螺春茶可以进行良好的区分。

2) 不同厂家的碧螺春茶在得分图中，A、G、H厂家的5个等级茶样分别聚到一起，且G、H厂家又明显混合聚在一起，表明G和H厂家不同等级碧螺春茶之间具有很大的相似性，没有进行很好的区分，因而聚到一起。而BT2、CT2、DT2、FT1等4个厂家中的碧螺春特级茶距离较近，与各自厂家的碧螺春非特级茶之间并没有很好的分开，表明一阶求导数据的处理结果不如原始数据结果明显，这可能与前3个主成分的累计贡献率有关。因而，一阶求导数据对于等级区分效果不明显。

3.2 偏最小二乘判别分析

偏最小二乘判别分析(PLS-DA)是一种监督模式识别方法，根据吸收值差异建立区别样品模型[12]。它可以分别提取自变量和因变量中能最大代表其特性的潜在变量，并对潜在变量进行线性或非线性回归建模，最终来预测方法的可行性[16-17]。将50个碧螺春茶样品的紫外指纹图谱的吸收波长和相应的吸光值导入SIMCA-P 14.0软件中，选择PLS-DA进行分析。

3.2.1 原始数据PLS-DA

对原始数据采用SIMCA-P 14.0软件自动优化，选择2个潜在主成分构建模型。结果显示，训练集2个潜在主成分的累计解释力R2为0.958。不同产地碧螺春茶原始数据的PLS-DA得分如图6所示。由图6可知，依据复杂的紫外光谱信息，得分图客观地显示了碧螺春茶的紫外光谱与不同产地、厂家和等级之间的关系；PLS-DA分析结果与相应的原始数据主成分分析结果相似，对于不同产地的碧螺春茶之间的区分效果明显，而对于不同等级碧螺春茶的鉴别提供了特级茶和非特级茶的区分效果，而对于其他等级的区分效果并不明显。

图6 洞庭碧螺春茶原始数据PLS-DA

3.2.2 一阶求导数据PLS-DA

对一阶求导数据采用SIMCA-P 14.0软件自动优化，选择2个潜在主成分构建模型。结果显示，训练集2个潜在主成分的累计解释力R2为0.702。不同产地碧螺春茶一阶求导数据的PLS-DA得分如图7所示。由图7可知，依据复杂的紫外光谱信息，得分图客观地显示了碧螺春茶的紫外光谱与不同产地、厂家和等级之间的关系；PLS-DA分析与一阶求导数据的主成分分析结果相似，对于不同产地碧螺春茶之间的区分效果明显，与原始数据处理结果可保持良好的一致性，而对于不同等级碧螺春茶的区分效果并不明显。

图7 碧螺春茶一阶求导数据PLS-DA

4 结论与讨论

1) 紫外光谱法具有操作方便、高效率、低成本等优点，已经被越来越多地应用到食品、制药、化工等领域[18-20]。本试验通过对50个碧螺春茶样品进行紫外光谱扫描，将所得紫外指纹图谱原始数据和一阶求导数据导入SIMCA-P 14.0软件中进行主成分分析，据此反映样品之间的相关性，同时利用具有监督模式的偏最小二乘判别分析对潜在变量进行模型的建立，最终预测方法的可行性[21]。

2) 通过试验确定了碧螺春茶的最佳提取溶剂为95%甲醇，最佳提取时间为40 min。碧螺春茶紫外光谱曲线重现性好、稳定性高。不同产地和不同等级碧螺春茶的紫外指纹图谱峰形比较相似，但吸光度不同，表明不同产地和不同等级之间的样品化学成分含量有一定的差异。

3) 本试验数据经SIMCA-P 14.0软件进行主成分分析，由原始数据和一阶求导数据的PCA得分图可知，洞庭东山和西山的碧螺春茶产地之间的距离较远，表明不同产地碧螺春茶之间的主要化学成分含量有差异，紫外光谱法对于不同产地碧螺春茶之间的区分效果较好。此外，对于不同等级碧螺春茶之间的鉴别效果，一阶求导数据所得结果不能很好地将等级进行区分。而原始数据所得结果可以初步地将碧螺春特级茶和非特级茶进行区分，但是对于特级一等、特级二等、一级、二级、三级碧螺春茶之间的区分效果并不明显。其原因可能是与碧螺春茶之间的主要化学成分含量本身就只有细微差异，而且由张颖彬等[22]的研究结果可知，碧螺春特级一等与特级二等，一级与二级分差较小，其余等级间分差较大。因此，等级之间较小分差可能导致不同等级的确切区分效果并不理想。此外，采用具有监督模式的PLSDA进行分析，所得结果与PCA分析结果较一致。

以上结果表明，采用紫外指纹图谱对于鉴别不同产地碧螺春茶具有较好的效果，但对于不同等级之间的区分效果并不明显。根据肖益等[23]的研究可知，不同品种茶叶在382 nm波长处的紫外吸收值具有比较明显的差异，采用紫外光谱技术可以快速对不同品种茶叶进行分类鉴别。而本试验中除了产地之间的不同之外，还有碧螺春茶的5个等级之间的区分。因此，在以后针对不同等级碧螺春茶之间的鉴别试验中，可通过增加产地个数和不同品种来进一步修正模型，以提高准确率。