娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液对小麦幼苗的促生作用

谢玉琴，马丹丹，杨 树，李 培，徐秉良，薛应钰

(甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州 730070)

小麦(Triticumaestivum)是世界四大粮食作物之一，为人类提供约20%蛋白质和21%食物热量[1]。中国是全球最大的小麦生产国和消费国，其持续发展为保障国内粮食安全和社会稳定做出了重要贡献[2]。2016年，中国小麦播种面积、总产量和单产分别为2.42×107hm2、1.29×108t和5.3×103kg/hm2[3]。预计到2050年，为了满足快速增长人口的需求，全球小麦产量仍需翻一番[4]。面对全球天气干旱和耕地面积缩减的突出问题，要实现产量翻番这一目标，提高单产是唯一途径[5]。长期以来，化肥的大量使用成为仅次于育种技术的保障粮食增产的重要措施之一，造成土壤板结、环境污染和品质下降等问题[6]。因此，寻求新的增产途径是目前小麦生产中亟待解决的热点问题。

放线菌种类繁多，能产生多种生物活性物质，这些活性物质不仅可以有效控制有害微生物的发展，对植物生长也有一定的促进作用[7-9]。近年来，在利用放线菌发酵液浇灌防病方面的研究报道较多，研究利用放线菌及其代谢产物对玉米[10]、番茄[11]、辣椒[12]、黄瓜[13]等多种作物的促生作用在国内外也有较多报道。有关促生菌对小麦促生作用的研究有：常慧萍等[14]研究发现，菌株HP1218浸种小麦种子，能显著促进小麦的生根和生长；刘拴成等[15]从玉米植株的根围土壤中筛选出1株解磷作用较强的芽孢杆菌CY18，可使小麦鲜质量、株高和根长增长；刘敏君[16]研究结果表明，木霉和青霉菌剂1∶1与土壤比例为 1∶15时，对小麦的促生效果最显著，在贫瘠土壤中也能明显使小麦株高、叶绿素等增加；马军妮[17]在2016年研究发现，密旋链霉菌(Act12)及娄彻氏链霉菌(D74)2株放线菌的菌粉，包衣小麦种子可显著影响小麦的生物学、光合生理及生化代谢，刺激小麦根系发育，促进小麦生长；刘玉涛[18]在2株链霉菌对小麦的促生机理的研究报道中指出，娄彻氏链霉菌D74和密旋链霉菌Actl2可促进小麦幼苗生长，其链霉菌剂用于种子包衣后，对小麦的生理生化特性及产量提高均有明显影响；常慧萍等[19]用HN1202、HP1218和HK1216菌液对小麦种子进行浸种处理，发现其对小麦幼苗根长有明显的促生作用等。众多研究报告指出，促生菌对小麦的生长代谢等均有明显的促进作用。

娄彻氏链霉菌(Streptomycesrochei)ZZ-9菌株(专利保存号：CGMCC No.15245)是甘肃农业大学植物病害生物防治实验室分离保存的一株具有自主知识产权的生防菌株。前期研究表明，该菌株对苹果树腐烂病菌(Cytosporasp.)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)等15种植物病原真菌均具有较好的抑制作用[20]，然而，作为一株优良的生防菌株，是否具有促生作用还未证实。研究该菌的促生作用，对于进一步开发其多功能生防制剂以及扩大其应用范围具有重要的意义。因此，本研究以娄彻氏链霉菌(S.rochei)ZZ-9菌株为试材，以小麦为靶标，测定其发酵液对小麦株高、根长、酶活性、叶绿素质量浓度和丙二醛质量摩尔浓度的影响，明确其促生作用，以期为新型生物制剂的开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株 娄彻氏链霉菌(Streptomycesrochei)菌株ZZ-9，由甘肃农业大学植物病害生物防治实验室提供。

1.1.2 供试种子 小麦种子‘西农979’，购自南阳兴农种业有限公司。

1.1.3 供试培养基 高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸钾1.0 g，磷酸氢二钾0.5 g，氯化钠0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂 18 g，蒸馏水1 000 mL。

高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸钾1.0 g，磷酸氢二钾0.5 g，氯化钠0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蒸馏水1 000 mL。

小米浸汁培养基：小米10 g，葡萄糖10 g，碳酸钙2 g，氯化钠2.5 g，蛋白胨3 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方 法

1.2.1 娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液的制备 ZZ-9菌株的活化培养：将ZZ-9菌株接种于高氏一号平板上，于28 ℃培养7 d。

种子液的制备：将活化好的ZZ-9菌株用打孔器打成菌柄，转接到装有60 mL高氏一号液体培养基的150 mL三角瓶中，每瓶接6个菌饼(d=6 mm)，置于28 ℃、180 r/min的摇床内，振荡培养72 h，制成种子液。

发酵液的制备：将制好的种子液，按10%的接菌量，接入到装有80 mL小米培养基的150 mL三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min的摇床振荡培养4 d后，既得发酵液[21]。

1.2.2 娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液对小麦幼苗的促生作用 选取大小均一、颗粒饱满的小麦种子，放在培养皿中，加入少量水，对小麦种子进行催芽处理(隔8 h换一次水)。至露白后，将发芽的小麦种子常规播种于盛有基质土(80%细碎泥炭、20%蛭石)的盆钵中(每盆种10颗种子，下文出现的“播种”方法与此相同)，然后进行灌根处理，用注射器将摇好的发酵液，以原液、50倍稀释、100倍稀释、150倍稀释、200倍稀释的不同剂量，分别于播种后0、10、20 d注入土中，以注入等量的水为对照(CK)，在每处灌根处理后10、20、30 d(也就是播种后10、20、30 d)，分别测量株高和根长，并测定叶绿素质量浓度和丙二醛的质量摩尔浓度及苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶的酶活性[22]。试验设3次重复。

1.2.3 幼苗形态指标测定 随机从各处理中抽取20株小麦幼苗，洗净吸干水分后，用直尺测定幼苗株高和根系长度。

1.2.4 物质含量和酶活性的测定 取各处理小麦幼苗第6～8片叶。用分光光度计测定小麦叶片的叶绿素质量浓度、丙二醛(MDA)质量摩尔浓度和酶活性(苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶)。MDA质量摩尔浓度的测定：采用紫外分光光度法[23-24]；叶绿素质量浓度测定：采用无水乙醇提取法[25-26]；苯丙氨酸解氨酶活力测定：采用苯丙氨酸比色法[27-28]；多酚氧化酶活力测定：采用邻苯二酚法[29]。

1.3 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2007对试验数据进行处理，使用SPSS 19.0中Tukey s-b法进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液对小麦幼苗形态指标的影响

2.1.1 小麦幼苗根长 由表1可知，不同剂量的ZZ-9菌株发酵液对小麦幼苗根长均有显著的促生作用。其中，ZZ-9菌株发酵液原液对小麦幼苗根长的促生作用明显高于CK，其促生作用显著强于不同稀释倍数的发酵液。随着ZZ-9菌株发酵液剂量的减小，其对小麦幼苗根长的促生作用逐渐减弱(图1)。

不同时间段浇灌ZZ-9菌株发酵液，对小麦幼苗根长有显著的促生作用。播种10 d后浇灌ZZ-9菌株发酵液(即播种后20 d)，对小麦幼苗根长的促生作用明显强于CK，而播种后灌根(即播种后10 d)的促生作用，明显强于播种20 d后灌根(即播种后30 d)的促生作用。

综上可知，在小麦幼苗播种10 d后，用ZZ-9菌株发酵液原液对小麦幼苗进行灌根，处理10 d，即小麦播种后20 d，对小麦幼苗根长的促生作用明显强于其他处理，可达49.8%(P<0.05)。

表1 不同剂量娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液处理后的小麦幼苗根长Table 1 Root length of wheat seedlings treated with different concentrations of Streptomyces loucheri ZZ-9 strain fermentation filtrate

注：数据为“平均数±标准差”。同列数据后不同小写字母表示经Duncan’s新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。下同 。

Note:The data are “mean ±standard deviation”.Different lowercase letters after the same column data showed significant difference at the level ofP<0.05 by Duncan’s new complex difference method.The same below.

A.原液 Undiluted; B.稀释50倍 Dilute 50 times; C.稀释100倍 Dilute 100 times; D.稀释150倍 Diluted 150 times; E.稀释200倍 Dilute 200 times; F.对照 Control；图2同 The same as Fig.2

图1 不同剂量娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液处理后的小麦幼苗根长
Fig.1 Root length of wheat seedlings treated with
different concentrations ofStreptomycesloucheriZZ-9 strain fermentation filtrate

2.1.2 小麦幼苗株高 由表2可以看出，ZZ-9菌株发酵液对小麦幼苗的株高有显著的促生作用。用不同剂量的ZZ-9菌株发酵液在小麦幼苗播种一定时间后灌根，较对照而言，ZZ-9菌株发酵液原液对小麦幼苗的株高促生作用最明显。同根长一样，其促生作用的强弱随发酵液剂量的减小而减弱(图2)。

用同一剂量的ZZ-9菌株发酵液在小麦幼苗播种后0、10、20 d分别进行灌根处理，于处理 10 d后(即小麦播种10、20、30 d后)分别测定小麦幼苗的株高，在小麦幼苗播种20 d后，ZZ-9菌株发酵液对小麦幼苗株高的促生作用明显强于其他处理。

综上可知，在小麦幼苗播种10 d后，用ZZ-9菌株发酵液原液对小麦幼苗进行灌根处理，其对小麦幼苗株高的促生作用明显强于其他处理，可达43.6%(P<0.05)。

2.2 娄彻氏链霉菌菌株ZZ-9发酵液对小麦幼苗MDA、叶绿素和酶活性的影响

2.2.1 小麦幼苗MDA质量摩尔浓度 由图3可知，用ZZ-9菌株发酵液处理过的小麦，MDA质量摩尔浓度明显低于CK。在播种一定时间后，用不同剂量的发酵液处理小麦幼苗，其剂量越小，MDA质量摩尔浓度降低越不明显。小麦幼苗播种0 d时，经发酵液处理，10 d后测得MDA较CK降低了29.20%～43.80%，其中，发酵液原液处理后，小麦MDA质量摩尔浓度明显降低，较对照降低了43.8%(P<0.05)。小麦幼苗播种10 d时，经发酵液处理，10 d后(即小麦播种20 d后)测得MDA质量摩尔浓度较CK降低了21.74%～53.62%，发酵液原液使小麦MDA质量摩尔浓度明显降低，较对照降低了53.62%(P<0.05)。小麦幼苗播种20 d后，经发酵液处理，10 d后(即小麦播种30 d后)测得MDA质量摩尔浓度较CK降低了10.26%～ 33.33%，发酵液原液处理后，小麦叶片MDA质量摩尔浓度明显降低，较CK降低了33.33%(P<0.05)。

表2 不同剂量娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液处理后的小麦幼苗株高Table 2 Plant height of wheat seedlings treated with different concentrations of Streptomyces loucheri ZZ-9 strain fermentation filtrate

图2 不同剂量娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液处理后的小麦幼苗株高Fig.2 Plant height of wheat seedlings treated with different concentrations of Streptomyces loucheri ZZ-9 strain fermentation filtrate

综上所述，小麦幼苗播种0 d后，用发酵液原液对小麦幼苗进行灌根处理，10 d后测得小麦MDA质量摩尔浓度较对照明显降低，即本处理最有利于增加小麦幼苗抗性。

2.2.2 小麦幼苗叶绿素质量浓度 由表3可知，用ZZ-9菌株发酵液处理小麦幼苗后，可使小麦叶片叶绿素质量浓度明显升高。小麦幼苗播种0 d后，经ZZ-9菌株发酵液处理10 d，测得小麦叶片叶绿素质量浓度较CK增加了12.6%～88.75%，其中，发酵液原液使小麦叶片叶绿素质量浓度明显增加，增幅为88.75%(P<0.05)。小麦幼苗播种10 d后，经ZZ-9菌株发酵液处理 10 d，测得的小麦叶片叶绿素质量浓度较CK增加了1.8%～ 56.53%，其中，发酵液原液处理后的小麦叶片叶绿素质量浓度明显增加，增幅为 56.53%(P< 0.05)。小麦幼苗播种20 d后，经ZZ-9菌株发酵液处理10 d，测得小麦叶片叶绿素质量浓度较CK增加了0.27～47.7%，发酵液50倍稀释液使小麦叶片叶绿素质量浓度明显增加，增幅为47.7%(P<0.05)，发酵液200倍稀释液对小麦叶片叶绿素质量浓度的影响不明显。

不同小写字母表示经Duncan’s新复极差法检验在P<0.05水平差异显著，下同 The different lowercase letters in the figure show significant difference at the level ofP<0.05 by Duncan’s new complex difference method，the same below

图3 不同剂量娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液处理后的小麦幼苗MDA质量摩尔浓度
Fig.3 MDA molality in wheat seedlings treated with different concentrations ofStreptomycesloucheriZZ-9 strain fermentation filtrate

因此，在小麦幼苗播种10 d后，用ZZ-9菌株发酵液原液对小麦幼苗进行灌根处理10 d，小麦幼苗叶片的叶绿素质量浓度明显增加，有利于促进小麦幼苗的光合作用及小麦体内物质能量的产生与积累。

表3 不同剂量的娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液处理后的小麦幼苗叶绿素质量浓度Table 3 Chlorophyll mass concentration of wheat seedlings treated with different concentrations of Streptomyces loucheri ZZ-9 strain fermentation broth

2.2.3 小麦幼苗多酚氧化酶(PPO)活性 由图4可知，娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液灌根后，小麦幼苗叶片PPO活性明显增加。用ZZ-9菌株发酵液对播种0 d 后的小麦幼苗进行灌根处理，10 d后测得其PPO活性较CK增加了 2.52%～84.16%，其中，发酵液原液处理后小麦叶片PPO活性明显增加，增幅为84.16% (P<0.05)。用ZZ-9菌株发酵液对播种10 d后的小麦幼苗进行灌根处理，10 d后，测得PPO活性较CK增加了14.26%～106.67%，其中，发酵液原液处理后小麦叶片PPO活性明显增加，增幅为106.67%(P<0.05)。用ZZ-9菌株发酵液对播种20d后的小麦幼苗进行灌根处理，10 d后，测得PPO活性较CK增加了1.96%～ 35.64%，其中，发酵液原液对PPO活性明显增加，增幅为35.64% (P<0.05)。

综上所述，用不同浓度的ZZ-9菌株发酵液处理小麦幼苗后，其对小麦叶片PPO活性的影响不同，表现为：ZZ-9菌株发酵液原液处理后小麦叶片PPO活性明显增加，随着ZZ-9菌株发酵液剂量的减小，小麦叶片PPO活性增幅也减小，稀释200倍以后，对小麦叶片PPO活性的影响不明显。因此，在小麦幼苗播种0 d之后，用ZZ-9菌株发酵液原液灌根处理小麦幼苗，小麦叶片PPO活性明显增加，有利于小麦幼苗抗病性的提高。

2.2.4 小麦幼苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性 由图5可知，经娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液灌根处理小麦幼苗后，小麦幼苗叶片PAL活性明显增强。用ZZ-9菌株发酵液对播种0 d后的小麦幼苗进行灌根处理10 d，测得PAL活性较CK增强了5.61%～ 32.30%，其中，发酵液原液处理使PAL活性明显增强，增幅为32.30%(P<0.05)。用ZZ-9菌株发酵液对播种10 d后的小麦幼苗进行灌根处理10 d，测得PAL活性较CK增强了16.19%～58.70%，其中，发酵液原液使PAL活性明显增强，增幅为58.70%(P<0.05)。用ZZ-9菌株发酵液对播种20 d后的小麦幼苗进行灌根处理10 d，测得PAL活性较CK增强了5.5%～18.4%，其中，发酵液原液对PAL活性明显增强，增幅为18.4%(P<0.05)。然而，用稀释200倍的ZZ-9菌株发酵液处理不同播种时间以后的小麦叶片，小麦叶片PAL活性增幅不明显。

图4 不同剂量娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液处理后的小麦幼苗PPO活性Fig.4 PPO activity of wheat seedlings treated with fermentation broth of Streptomyces loucheri ZZ-9 at different concentrations

因此，在小麦幼苗播种0 d后，用ZZ-9菌株发酵液对其进行灌根处理10 d，其PAL活性明显增强，该处理有利于提高小麦抗病性。

图5 不同剂量娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液处理后的小麦幼苗PAL活性Fig.5 PAL activity of wheat seedlings treated with fermentation broth of Streptomyces loucheri ZZ-9 at different concentrations

3 结论与讨论

近年来，利用微生物研发各种微生物菌剂用于植物防病及促生的研究已逐年增加，关于根际促生菌、生防放线菌的研究已成为当前研究的热点。娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株是一株生防放线菌，此前关于其研究还较少。目前，关于娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株的研究表明，该菌对15种植物病原真菌均有抑制作用，其次生代谢产物能适应高温、强酸碱等多种环境，有较好的稳定性[20]，因而为后期生物菌制剂及促生作用的研究奠定基础。但是，有关于该菌在植物促生作用上的研究还未见报道。

本试验以娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株为试材，以非宿主小麦为靶标，通过室内试验，测定了娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液对小麦幼苗的促生作用。结果表明，用娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液原液对小麦幼苗进行灌根处理，对小麦幼苗株高、根长均有明显的促进作用，株高和根长增幅分别为43.6%(P<0.05)和49.8%(P<0.05)，此结果与李堆淑[30]在不同浓度的A4发酵液对小麦幼苗根长及株高影响研究的结果相一致，而本试验结果对小苗幼苗根长及株高的促进作用更明显。通过测定小麦幼苗同一叶位叶片的MDA、叶绿素和酶活性，可以得出，用ZZ-9菌株发酵液处理过的小麦幼苗，小麦幼苗叶片PPO活性和PAL活性明显增加，增幅分别为106.67%(P<0.05)和58.70%(P<0.05)，MDA质量摩尔浓度明显降低，较对照降低了53.62%(P<0.05)，小麦叶片叶绿素质量浓度明显升高，较CK增加56.53%(P<0.05)。植物在抵御病原微生物的侵染过程中，抗性相关酶发挥了重要作用，酚类代谢系统中的一些酶和病原相关蛋白家族PPO，可以通过催化木质素及醌类化合物，形成保护性屏蔽，使细胞免受病菌的侵害，也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用；而诱导酶PAL活性与植物抗病性呈正相关，PAL活性越大，则植物抗病性越强[31]。本研究中，小麦幼苗叶片PPO活性和PAL活性明显增加，此研究结果与马军妮[17]用D74和Act12菌剂共同处理小麦幼苗后对PPO活性和PAL活性的研究结果相一致，且本试验中对其诱导酶活性的影响较明显，增幅更大。因而，本试验结果可说明，娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液，有显著提高小麦幼苗抗性的作用。此外，MDA质量摩尔浓度可以反映植物细胞膜脂过氧化程度，反映生物体衰老和遭受逆境伤害的程度[32]，MDA质量摩尔浓度高，则植物细胞膜脂过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重。本试验中MDA质量摩尔浓度明显降低，此结果与田小曼等[33]在2株生防菌FO47、153对小麦生长发育研究中的结果相一致，但本试验中，MDA质量浓度降低更明显，说明经娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液浇灌的小麦幼苗，明显降低了细胞膜脂过氧化程度，减缓了对细胞膜的损伤，提高了小麦幼苗抗逆境生长的能力。叶绿素是高等植物和其他所有能进行光合作用的生物体含有的一类绿色色素，叶绿素的多少直接影响植物光合作用的强弱及植物体内物质能量的产生与积累[34]。本试验中小麦幼苗叶片的叶绿素质量浓度较CK明显增加，此研究结果与峥嵘[35]在5406放线菌对小麦幼苗叶绿素含量影响的研究结果相一致，且本试验菌株娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液浇灌的小麦幼苗，其叶绿素质量浓度增加明显，有利于促进小麦幼苗的光合作用及小麦幼苗体内物质能量的产生与积累，进而减少小麦在幼苗阶段的损失，为后期壮苗、健苗及高产奠定基础。

综上所述，用娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株发酵液原液处理播种0 d后的小麦幼苗，其促生作用明显，是一株值得深究的生防菌。综合对该菌已有的研究可推断，ZZ-9菌株是通过抑制根际病原菌及根际DRMO菌来表现其对植物的促生作用的。但本试验仅对娄彻氏链霉菌ZZ-9菌株在室内条件下进行了为期1个月的短期试验，对小麦后期生长及对产量的影响尚未明确，对于在生产过程中的具体影响还需进一步研究。