盐胁迫下盐穗木miR393b与预测靶基因HcTIR1的表达及相关性

王鹏举，黄世平，杨瑞瑞，曾幼玲

(新疆大学生命科学与技术学院/新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046)

0 引 言

【研究意义】盐渍化是影响植物生长、限制农作物产量的重要因素。盐胁迫会引发一系列的氧化胁迫、渗透胁迫和离子胁迫，导致植物细胞膜损伤和细胞内渗透物质改变，使植物的生长受到影响。盐生植物在进化过程中形成的独特机制来调控对盐胁迫的应答[1]，miRNA对靶基因的作用就是其中重要的调控途径。microRNA作为一类非编码内源小分子RNA，通过负调控相应的靶基因影响植物的生物学过程。盐穗木(Halostachys caspica)广泛分布于新疆盐碱干旱地区，属于藜科(Chenopodiaceae)极端耐盐的盐生灌木。microRNA作为一类非编码内源小分子RNA，通过负调控相应的靶基因影响植物的生物学过程。盐穗木(Halostachys caspica)广泛分布于新疆盐碱干旱地区，属于藜科(Chenopodiaceae)极端耐盐的盐生灌木。研究盐穗木miR393b及预测靶基因HcTIR1在高盐胁迫条件下的表达模式与其二者的相关性，对于深入理解盐穗木耐盐分子功能和调控机制具有重要的意义。【前人研究进展】植物miRNA参与到各种生物进程中，如植物信号转导、植物生殖和营养器官的生长发育和对各种生物和非生物胁迫的响应[2-4]，其在基因调控网络中占有相当重要的地位[5]。铝处理24h的植物亚麻，miR319、miR390和miR393的表达呈现下调[6]。miR393家族成员在大多数植物种中是比较保守的，其靶基因主要是转录因子碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)以及生长素受体F-box(AFBauxinsignalingF-boxproteins)蛋白(TIR1、AFB1、AFB2和AFB3)。TIR1蛋白是植物中的生长素受体，转基因拟南芥中TIR1的转录被miR393切割，miR393在ABA或渗透胁迫条件下抑制侧根生长，通过表达TIR1可以消除这种抑制作用[7]。大豆TIR1和大豆AFB3介导的生长素信号，能促进大豆根瘤生长，表明大豆的TIR1和大豆AFB3在大豆的根瘤形成中起关键作用[8]。在硝酸盐处理下，拟南芥miR393过表达，其靶基因AFB3的表达水平降低[9]。Luo等[10]在对玉米感染带状叶枯病后，检测到玉米miR393b与预测靶基因TIR1的表达量呈负相关性，玉米miR393b表达下调，TIR1表达上调，生长素敏感性增强，玉米叶鞘发育受影响，推测靶基因TIR1通过激活生长素信号转导途径，以响应带状叶枯病胁迫，加强玉米的形态和代谢适应。miRNA海绵是一种用于体内高效抑制miRNA的方法，研究采用该技术构建了miR393(pBI-393-s)的miRNA海绵载体，在NaCl和ABA胁迫下，转miR393海绵载体幼苗中TIR1的表达量比野生型的高，并且增强了转基因拟南芥对盐和ABA胁迫的耐受性；萌发率、根长、叶绿素含量皆高于野生型，miR393基因功能丧失植株耐盐性增强，说明miR393基因对盐敏感[11-12]。先前的研究表明，过表达miR393的转基因植物对盐和ABA处理比野生型植物敏感，Chen等[13]分别过表达miR393a、miR393b、mTIR1(竞争性miR393基因)和TIR1的突变体tir1的转基因拟南芥株系，mTIR1基因的过量表达明显增强了耐盐性，提高了萌发率、降低离子运输速率、减少了水分损失、抑制根系伸长、延缓衰老、降低死亡率、稳定叶绿素含量，相反，miR393转基因植株和TIR1突变体具有mTIR1植物相反的特性。水稻miR393响应盐胁迫，过表达水稻OsmiR393植株比野生型对盐碱胁迫更敏感[14]。在拟南芥外植体培养中发现，miR393a过表达时外植体芽的分化受到抑制，且将TIR1基因转入拟南芥后恢复正常，用mTIR1基因抑制miR393a发挥作用，发现外植体芽的分化增强，miR393a和TIR1所发挥的功能相反，说明二者可能相互拮抗影响了外植体芽的分化[15]。植物miR393家族的表达随不同环境和时间发生变化，如生长素信号转导途径，其预测靶基因TIR1响应非生物胁迫[16]。miR393和TIR1的表达具有一定的负相关性，miR393能增强植物对盐胁迫的敏感性，相反，TIR1通过ABA信号转导途径和生长素信号转导途径增强植物的耐盐性，并参与了生长发育过程。【本研究切入点】盐穗木(Halostachys caspica)是在极端盐碱干旱环境下生长的高度肉质化多年生藜科(Chenopodiaceae)盐生灌木。miR393b响应盐胁迫，在高盐胁迫盐穗木根的小RNA文库中表现上调。【拟解决的关键问题】研究以新疆盐生植物盐穗木为研究材料，采用生物信息学方法预测盐穗木miR393b的靶基因，通过qRT-PCR方法检测盐胁迫下盐穗木miR393b及预测靶基因HcTIR1的相对表达模式，二者呈现一定的负相关性，对于深入理解盐穗木耐盐分子功能和调控机制具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

盐穗木种子采集于新疆古尔班通古特沙漠边缘，种子种植于花盆于温室中培养(温度25℃左右，光照时间16h/d，34μmol/(m2·s)。植株生长到约90d，进行400、600mmol/LNaCl盐胁迫分别处理0、3、6、12、24、48、72h(自来水浇灌的盐穗木作为对照)，收获盐穗木的同化枝作为样品。不同处理样品三个生物学重复。将所有采集的样品收集后，立即放入液氮中冷冻并保存至-80℃冰箱，用于后续real-timePCR检测实验。

1.2 方 法

1.2.1RNA提取

总RNA的提取步骤参照天根PlantTotalRNA提取试剂盒说明书操作。

1.2.2cDNA的合成与荧光定量

利用polyA加尾法对totalRNA进行反转录合成cDNA。按照TaKaRa公司SYBR®PrimeScriptTMmiRNART-PCRKit进行miRNA的荧光定量实验。

按照M-MLVReverseTranscriptase试剂盒(TaKaRa)和Oligo(dT)18primer等反转录试剂合成cDNA用于定量分析。按照SYBR®SelectMasterMix(AppliedBiosystems)操作说明进行靶基因的荧光定量试验。表1

HcmiR393b的检测以5SrRNA为内参，HcTIR1以β-actin为内参，使用ABI7 500荧光定量PCR仪获得实验数据及使用2-△△ct法分析数据, 并利用软件Prism5.0作图，分析盐穗木miR3 93b及预测靶基因HcTIR1在盐胁迫下的表达模式。

表1 所用引物序列
Table1Primersequencesusedintheexperiments

名称 Name引物Primer 引物序列(5’-3’) Primer sequence(5’-3’)miR393bGGTCCAAAGGGATCGCATTGATTTHcTIR1-P1GCCGAAAATCGCCCTAACCTAHcTIR1-P2ACCAATAATGCTCTCCCACCAqRT-PCRHc5S rRNA-P1ACCCGATCCCATTCCGACHc5S rRNA-P2TGTCTCCCGAACAATCTCAGTACHcβ-actin-P1AAGATCTGGCACCACACCTTCHcβ-actin-P2CACACCATCACCAGAATCGA

2 结果与分析

2.1 盐穗木miR393b成熟体序列比对及预测靶基因的靶向预测

从前期获得的600 mmol/L NaCl处理48 h盐穗木根的小RNA文库中,筛选获得表达显著差异的基因miR393b，比对双子叶不同科植物盐穗木、拟南芥、苹果、菊芋等和单子叶不同科植物水稻和芦笋的miR393b的序列结果表明miR393b在不同植物种中高度保守(图1A)。

利用植物miRNA与其靶基因之间的高度互补性可以有效预测miRNA的靶基因[17-18]。利用盐穗木转录组数据预测到miR393b可能的靶基因HcTIR1(图1B)，HcTIR1基因可能受到miR393b调控。图1

图1 盐穗木miR393b成熟体与相应的不同植物中miR393b的比对(A)及靶基因预测(B)
Fig.1 Alignment ofH.caspicamiR393b with those of different plant species (A) and prediction of target gene with its transcriptome data(B)

2.2 盐胁迫处理盐穗木miR393b与预测靶基HcTIR1的表达模式

分析盐穗木miR393b与其预测靶基因HcTIR1在高盐条件下的表达模式和相关性，实施了RNA水平的基因表达real-time PCR实验。研究表明，400和600 mmol/L NaCl不同盐浓度处理下，盐穗木同化枝miR393b和预测靶基因HcTIR1的表达呈现相似的趋势，miR393b随着胁迫时间的延长表现先下降后升高的趋势，HcTIR1表达大致呈现先升后降的趋势，其二者的基因表达负相关性在600 mmol/L NaCl 高盐处理表现更为明显。图2

图2 400和600 mmol/L盐胁迫处理盐穗木同化枝miR393b及其预测靶基因HcTIR1的相对表达(A、B和C、D)和相关性(3 h(E)和48 h(F))
Fig.2 Expression pattern (A, B and C, D) and correlation (3 h (E) and 48 h (F)) ofH.caspicabranch miR393b and predictive target geneHcTIR1 under the treatment of 400 and 600 mmol/L NaCl stress

3 讨 论

盐胁迫是限制植物生长发育的一类环境限制因子。植物在生长过程中受到不同逆境胁迫时，能够上调或下调miRNA或者其预测靶基因的表达。某些miRNA的一些靶基因能够映射到与盐胁迫相关的通路上，例如钙离子信号通道、MAPK信号通路、植物激素信号转导、类黄酮合成、泛素介导的蛋白降解途径、凋亡途径、ABC转运子、peroxisome、DNA损伤[19-22]。TIR1就是一类映射到植物激素信号转导通路中的关键基因，在盐胁迫下，拟南芥miR393对TIR1生长素受体有负调控作用，导致生长素信号通路受阻，从而抑制幼苗的生长[23]。

miRNA作为一种转录后调控因子，其在表达上具有时序性、组织特异性和胁迫浓度的依赖性[24-25]。Iglesias等研究表明，拟南芥在受到盐胁迫时通过加强拟南芥miR393a突变体的转录提高植物中的突变体基因的表达量，其靶基因TIR1和AFB2等[26]生长素受体的含量被抑制，突变体转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性增强。通过不同盐浓度不同时间处理盐穗木，其同化枝中miR393b与预测靶基因HcTIR1的表达模式和相关性的分析结果显示,两基因的表达在高盐胁迫下响应盐胁迫，并且呈现良好的负相关性，推测盐穗木miR393b及其预测靶基因HcTIR1可能参与盐胁迫的过程。

生长素是植物体内重要的内源激素，参与到植物生长和发育的诸多过程。miR393作为植物激素信号转导通路上一个重要的调控因子，有报道也参与到逆境响应的通路中，探讨盐生植物盐穗木miR393b与预测靶基因HcTIR1在耐盐中的作用，为解析和丰富盐穗木的耐盐机理具有理论意义。

4 结 论

盐穗木是一种极端耐盐茎叶高度肉质化的藜科盐生植物。从高盐胁迫盐穗木根的小RNA文库中筛选获得表达显著上调的基因miR393b，从盐穗木转录组数据库中生物信息学预测到其靶基因为HcTIR1(transportinhibitorresponse1)；不同植物种的成熟体miR393b序列具有很高的同源性；qRT-PCR的结果显示,盐穗木miR393b和预测的靶基因HcTIR1二者均响应高盐胁迫且呈现负相关性，随着盐胁迫浓度的升高，其负相关性更明显。