FAM134B在肝癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

袁 野，马丹丹，张建新，钟蓝海，萧正康，张智勇

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)简称肝癌，是高度恶性的肿瘤[1]。据国际癌症研究机构统计，肝癌发病率在全球位居男性癌症第5位，女性癌症第7位，死亡率在癌症相关死因中位列第三[2-3]。肝癌5年生存率在过去10年没有显著提升，仅为10%[4]。大量增殖和侵袭转移是肝癌患者病死率高及临床疗效差的关键，机制不明[5-6]。因此，探究肝癌发生发展机制对改善预后以及寻找肝癌诊疗靶点至关重要。Tang et al[7]报道134序列相似的家庭成员B (family with sequence similarity 134, member B, FAM134B)最早在食管鳞状上皮癌中被发现，且与该肿瘤恶性表型有关。但关于FAM134B在肝癌中的作用和机制研究未见报道。该研究将以肝癌临床标本及相应病例资料为基础，探讨FAM134B在肝癌中的表达及临床意义，以期为寻找肝癌新的临床诊疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集2016年1月～2017年12月在中国人民解放军中部战区总医院接受手术治疗的42例肝癌患者的组织标本及临床病理资料。本研究获得该院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。手术切除病变肝癌组织标本及癌旁组织标本后，立即置入液氮中保存。42例患者的临床病理资料包括：性别、年龄、肿瘤数目、乙肝、肝硬化、血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、肿瘤大小、肿瘤包膜完整情况、卫星灶、邻近组织侵犯、门静脉癌栓、肝外转移、Child分级、BCLC分期等。

1.2 主要试剂FAM134B和GAPDH一抗及二抗均购自英国Abcam公司；TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒均购自大连TaKaRa生物技术有限公司；总蛋白抽提试剂盒、蛋白浓度检测试剂盒均购自美国Invitrogen公司；细胞培养基、血清、胰酶均购自日本Sigma公司；免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物公司；HepG2细胞与L02细胞均保存于本院中心实验室液氮罐。

1.3 Real-time PCR检测FAM134B mRNA表达运用TRIzol试剂盒提取mRNA、逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，低温保存备用。Real-time PCR总反应体系为20 μl，其中SYBR Green mix缓冲液10 μl，上下游引物各0.6 μl(浓度为10 μmol/L)，cDNA 2 μl。反应条件为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。FAM134B与GAPDH引物见表1。

表1 Real-time PCR引物的基因序列

1.4 免疫组织化学染色及结果判定免疫组织化学染色按试剂盒实验步骤操作，制作石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，抗原修复，FAM134B抗体(1 ∶1 000稀释)孵育，二氨基联苯氨(DAB)显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片固定。免疫组织化学染色结果判定标准：未见阳性细胞或阳性细胞率<5%判定为阴性(-)，阳性细胞率5%～25%定为弱阳性(+)，25%～50%为中度阳性()，>50%为强阳性()。中度阳性及强阳性均判定为阳性表达。

1.5 Western blot检测FAM134B蛋白表达肝癌组织和癌旁组织分别称重并切成小块置于EP管(eppendorf管)中，EP管中加入含蛋白酶抑制剂的蛋白质抽提试剂，反复研磨组织，冰上裂解30 min，使组织尽可能完全裂解，得到裂解液；小心刮下L02细胞及HepG2细胞，并转移至EP管中，加入含蛋白酶抑制剂的蛋白质抽提试剂，得到裂解液。将裂解液离心取上清液即得到蛋白样品。二喹啉甲酸(BCA )法测定蛋白浓度。根据目的蛋白的分子量选择相应的分离胶和浓缩胶，以恒定电压80 V行SDS-PAGE电泳分离。蛋白电转移至PVDF膜，FAM134B及GAPDH孵育一抗(1 ∶1 000稀释)，4 ℃过夜，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。孵育二抗 (1 ∶3 000稀释), 室温摇床1 h，再次TBST洗膜3次，每次10 min.化学发光法曝光检测。免疫印迹条带的灰度值经灰度扫描仪分析后获得。

2 结果

2.1 IHC检测FAM134B蛋白表达FAM134B在42例肝癌组织及癌旁组织均有表达，详见图1。依据判定标准，FAM134B在癌旁组织中为阴性、弱阳性或中度阳性，但在肝癌组织中为弱阳性、中度阳性或强阳性。经统计得FAM134B在肝癌组织及癌旁组织阳性表达率分别为83%(35/42)和33%(14/42)，差异有统计学意义(χ2=12.343，P<0.05)。

图1 FAM134B在癌旁组织及肝癌组织中的表达 DAB染色×200 A:癌旁组织；B:肝癌组织

2.2 Real-time PCR检测FAM134B基因表达结果FAM134B在肝癌组织中的mRNA表达高于癌旁组织(t=22.084,P<0.05)。并且FAM134B在HepG2细胞中的mRNA表达高于L02细胞(t=19.985,P<0.05)，见图2。

图2 Real-time PCR检测FAM134B的mRNA表达

与癌旁组织比较：*P<0.05；与L02细胞比较：#P<0.05

2.3 Western blot检测FAM134B蛋白表达结果FAM134B蛋白在HepG2细胞中的表达高于L02细胞，FAM134B在肝癌组织中的蛋白表达同样低于癌旁组织。见图3。

图3 Western blot检测FAM134B的蛋白表达

2.4 FAM134B蛋白表达水平与肝癌临床病理特征之间的关系FAM134B蛋白表达量与肿瘤大小(t=1.089，P<0.05)、血清AFP(t=-7.273，P<0.05)、门静脉癌栓(t=6.309，P<0.05)、肝外转移(t=6.640，P<0.05)、邻近器官侵犯(t=7.959，P<0.05)和分化程度(t=6.115，P<0.05)显著相关，即FAM134B表达量增高时，肿瘤更大、AFP更高、邻近器官侵犯更多、分化程度更低，且存在门静脉癌栓和肝外转移。然而与性别、年龄、乙肝、肝硬化、淋巴结侵犯无明显相关性(P>0.05)。FAM134B在AFP表达水平正常的肝癌标本中部分(42.86%，12/28)高表达。见表2。

表2 FAM134B蛋白表达量与肝癌临床病理特征之间的关系

3 讨论

FAM134B是一个相对较新的分子，目前国内外关于FAM134B在人类疾病中的作用研究较少，2007年，Tang et al[7]发现FAM134B在食管鳞状细胞癌中促进癌细胞生长和增殖，表现为癌基因的特性。相反在2014年，相关研究[8-9]显示FAM134B在结肠癌中抑制癌细胞生长增殖和侵袭转移，表现为抑癌基因的特性。FAM134B在不同的肿瘤中发挥不同的作用激发了笔者极大的研究兴趣。鉴于FAM134B在肝癌中发挥的作用及机制研究目前是空白的，且研究[10-11]表明FAM134B突变与癌症患者临床病理特征密切相关。因此本研究致力于研究FAM134B与肝癌患者临床病理特征的关系，探讨其临床意义。

癌症是由信号通路中的促进细胞生长和增殖的原癌基因与调节细胞分裂和存活的抑癌基因失调而发展的细胞疾病[12]，原癌基因的异常表达或抑癌基因被抑制将导致癌症进展[13]。本研究中免疫组化检测结果显示FAM134B在肝癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织。Real-time PCR和Western blot检测结果均显示FAM134B在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且在HepG2细胞中的表达显著高于L02细胞。可见，FAM134B在肝癌中呈高表达，发挥癌基因特性。本研究结果与Tang et al[7]的报道一致，与Kasem et al[8]及Islam et al[9]的报道相反。

本研究通过统计分析FAM134B蛋白表达与42例肝癌患者临床病理特征之间的关系得出：FAM134B在肝癌组织中高表达与肝癌患者的性别、年龄、乙肝、肝硬化与淋巴结侵犯无明显相关。但FAM134B表达量增高时，肿瘤更大、AFP更高、邻近器官侵犯更多、分化程度更低。且存在门静脉癌栓和肝外转移的患者FAM134B表达量更高。结果提示FAM134B可能在肝癌发生发展、侵袭转移中发挥一定的促进作用。肝癌患者的预后与早发现、早诊断、早治疗有直接关系[3]。目前，AFP有助于筛查和早期诊断肝癌[14]，但AFP也有其局限性，即只有40%～60%的肝癌患者AFP增高，尚有部分肝癌患者的血清AFP水平并没有显著升高。如果这部分肝癌患者仅用AFP这一生化检测指标来筛查和早期诊断肝癌，则容易造成漏诊。因此探索更多生物学指标来增强肝癌早期诊断的精确性、灵敏度和特异度具有较大的临床意义。本研究中，FAM134B在AFP表达水平正常的肝癌标本中高表达，达42.86%。因此，本研究结果提示FAM134B可能是AFP阴性肝癌的潜在早期诊断指标。