苗药四大血对胶原诱导性关节炎大鼠的作用研究

李欣芯，石光玉，陶 然，赵丽萍，黎曼英，吴 艳，冯有为，陈 勇，孙见飞，吴 宁

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)属于一种自身免疫性疾病，累及人体许多组织与器官，并以对关节的破坏为主，患者呈全球性分布[1]。目前，关于RA的发病原因及机制尚不完全清楚，以消炎镇痛、控制病情发展为主的临床治疗未有良好的疗效。四大血由五花血藤、鸡血藤、黑骨藤、见血飞四味藤本药材组成，是苗族地区通气散血的代表天然药物。具有活血、舒筋、行瘀、止痛、祛湿之功，用于治疗风湿关节疼痛、肢体麻木、跌打损伤、创伤出血等病症[2-3]。该研究主要探究苗药四大血用于胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠的疗效及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料及主要仪器实验动物：36只清洁级雄性SD大鼠，体质量180～220 g，于18～26 ℃,相对湿度40%～70%下饲养；雷公藤多苷购自黄石飞云制药公司；牛II型胶原购自美国Chondrex公司；白介素-17(interleukin-17，IL-17)试剂盒购自深圳子科生物技术公司；水平电泳槽DYY-Ⅲ 31D购自北京六一仪器厂；Quanity One凝胶成像分析系统购自美国BIO-RAD公司；酶标仪购自美国BIO-TEK公司。

1.2 模型制备及动物分组将等体积的牛Ⅱ型胶原(4 mg/ml)与弗氏不完全佐剂在冰浴条件下充分乳化，在水中不散开即可使用(浓度为2 mg/ml)[4]。每只大鼠取0.2 ml在尾根及左足垫部皮下注射，空白组用等体积生理盐水代替。1周后加强免疫一次。造模成功后，按10 ml/kg给予大鼠灌胃治疗。四大血高、中、低剂量组药物浓度分别为4、2、1 g/ml，阳性药物组按40 g/kg灌胃雷公藤多苷片，空白组及模型组用等量生理盐水代替。灌胃21 d。

1.3 大鼠足肿胀度及关节指数测定采用自制大鼠足部容积测量仪，于造模前1 d开始，每隔1周测量1次大鼠右足跖部体积。并于大鼠灌胃前、灌胃1周、灌胃2周、灌胃3周时采用5级评分法评价大鼠关节炎指数(arthritis index，AI)[5]。将未注射乳化剂的其它关节积分累计起来，即为每只大鼠的评分，最高为12分，积分越高表示关节炎症越严重。

1.4 滑膜组织切片观察关节病理及核因子-κB p65(nuclear factor-kappa B p65，NF-κB p65)免疫组织化学观察。取下大鼠膝关节滑膜立即用4%中性甲醛固定，固定24～48 h后放入EDTA溶液中脱钙处理。经浓度梯度酒精脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，分别进行常规HE染色及IHC染色观察，NF-κB/p65稀释度为1 ∶50。

1.5 IL-17含量检测ELISA法测定大鼠血清IL-17：将取出的全血室温静置20 min，3 000 r/min 离心15 min，取血清按ELISA试剂盒操作检测IL-17含量，并根据450 nm处测定的光密度(optical density，OD)值绘制曲线并计算各样本浓度。

1.6 蛋白免疫印迹检测Western bot法检测NF-κB p65、核因子κB抑制蛋白α(NF-Kappa-B inhibitor alpha，IκB-α)含量：按每孔40 μg总蛋白量上样于12% SDS-PAGE胶上电泳分离，后转印至PVDF膜，室温振荡封闭2 h。将一抗稀释(IκB-α为1 ∶1 000，NF- κB p65为1 ∶1 500)后与膜4 ℃反应过夜；TBST漂洗10 min×3次，后加入适当稀释的二抗工作液室温摇动1 h，TBST漂洗10 min×3次；曝光并分析其灰度值。

2 结果

2.1 大鼠足部肿胀度观察造模前各组大鼠右足跖体积无差异。而在灌胃前，各实验组与空白组大鼠右足跖体积有显著差异。灌胃治疗3周后，四大血高、中、低剂量组以及阳性药物组均能抑制大鼠足肿胀，差异有统计学意义(F=7.681，P<0.05)。见表1。

2.2 大鼠AI评分变化AI 评分是评价 CIA 模型关节炎发病的客观指标之一，各组大鼠AI评分可见表2。灌胃治疗前，模型组的大鼠AI升高；灌胃治疗两周后，各组AI有所下降，但是除四大血高剂量组外差异均无统计学意义(P>0.05)，而在治疗3周之后，四大血治疗组的AI与模型组比较差异有统计学意义(F=28.715，P<0.01)。

2.3 大鼠血清IL-17含量变化大鼠血清IL-17含量变化见表3。模型组IL-17含量明显高于空白组；四大血高、中剂量及阳性药物组IL-17含量有明显下降，与模型组比较，差异有统计学意义(F=4.74，P<0.05)；而四大血低剂量组与模型组无明显差异，提示四大血低剂量组对CIA大鼠血清IL-17的影响较小。

表1 各组大鼠足部肿胀度变化

与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：##P<0.01；与阳性药物组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01

表2 各组大鼠AI评分

与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01；与阳性药物组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01

图1 各组大鼠HE染色

表3 各组大鼠血清IL-17含量变化

与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01；与阳性药物组比较：▲▲P<0.01

2.4 大鼠滑膜组织病理切片观察空白组大鼠滑膜组织由1～2 层滑膜细胞构成，分布紧密、整齐，无炎症细胞的浸润及血管增生；模型组大鼠滑膜组织排列紊乱、增生明显，多达5～6层排列，且组织水肿严重，周围可见大量炎性细胞浸润、血管增生现象，在软骨面，还可见部分软骨细胞增生。四大血低剂量组较模型组的滑膜组织有所改善，增生及炎细胞浸润现象均减少；而四大血中剂量、高剂量及阳性药物组则能明显改善滑膜组织病理状况，仅可见少量的炎性细胞浸润及新生组织血管，增生较少，没有明显的软骨及骨组织的破坏。结果提示四大血能较好地改善CIA模型大鼠关节组织病理状况，且高剂量组改善明显。见图1。

2.5 大鼠滑膜组织NF-κB p65免疫组织化学观察切片中染色为棕黄色的细胞即可视为阳性细胞，其胞质及胞核都可见染色，但胞核染色较深。模型组大鼠关节滑膜中可见强阳性，并可见滑膜位置有增生和损伤，而空白组未见阳性区域。经阳性药物雷公藤和四大血治疗后，NF-κB p65表达下降(F=67.776，P<0.05)；且四大血高、中剂量组与阳性药物比较差异无统计学意义。见图2、3。

2.6 大鼠滑膜组织NF-κB p65、IκB-α蛋白的表达大鼠滑膜组织NF-κB p65、IκB-α蛋白表达水平见图4、5。分子量约65、39 ku处清晰可见NF-κB p65及IκB-α蛋白条带。模型组NF-κB p65蛋白表达量明显高于空白组；而相较于模型组，四个给药组表达量下降，其中高剂量组和阳性药物组差异有统计学意义(F=47.154，P<0.01)。模型组抑制蛋白IκB-α的下降与空白组的差异有统计学意义，而各治疗组较模型组蛋白表达量上调(F=12.420，P<0.01)。而与阳性药物组比较，四大血高、中剂量组差异无统计学意义。

图2 各组大鼠NF-κB p65表达情况

A:模型组；B：空白组；C：阳性药物组；D：四大血高剂量组；E：四大血中剂量组；F：四大血低剂量组；与空白组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01；与阳性药物组比较：▲▲P<0.01

图3 各组大鼠NF-κB p65免疫组织化学染色 ×400

A：空白组；B：模型组；C：四大血低剂量组；D：四大血中剂量组；E：四大血高剂量组；F：阳性药物组

图4 各组大鼠NF-κB p65、IκB-α蛋白表达

A：四大血高剂量组；B：四大血中剂量组；C：四大血低剂量组；D：阳性药物组；E：空白组；F:模型组

图5 各组大鼠NF-κB p65、IκB-α蛋白的表达

与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01；与阳性药物组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01

3 讨论

类风湿性关节炎是一种可导致关节炎症及其功能障碍的免疫性疾病，其主要病理特征表现为：大量炎性细胞浸润及滑膜、血管增生，并导致血管翳形成及软骨和骨的损坏等，最终可表现为关节的畸形[6]。本实验利用牛Ⅱ型胶原造模后，大鼠足跖部出现了明显肿胀及行走不稳，AI评分发现其产生了继发性影响，提示造模成功。经四大血治疗3周后，HE染色可看出模型组大鼠滑膜组织水肿及增生明显，且其周围有大量炎性细胞浸润，而经治疗后的大鼠，能明显改善滑膜组织病理变化，仅可见少量的炎性细胞浸润及新生组织血管，增生较少，没有明显的软骨及骨组织的破坏。

研究[7]证实多种促炎细胞因子介导的炎症反应在滑膜的病变过程中起重要作用。而NF-κB是参与炎症细胞因子表达的主要转录因子之一，在RA发病机制中起关键的调控作用[8]。IL-17是一种较强炎性细胞因子，高水平的IL-17可通过促进IκB的磷酸化而激活NF-κB信号通路，活化的NF-κB促进辅助性T淋巴细胞(helper T cell, Th)向Th1细胞转化，使成纤维细胞大量分泌炎性因子IL-6和IL-8，进而促使Th17分泌IL-17，进一步加重类RA症状[9]。本实验检测IL-17表达量的变化，结果显示，模型组 IL-17含量较空白组显著升高，而经四大血治疗后，各组大鼠IL-17含量下降，且四大血中、高剂量组与阳性药物组接近，提示四大血治疗RA作用可能与其抑制炎性因子 IL-17表达相关。而在IHC和Western blot的结果中， 各治疗组较模型组NF- κB p65表达减少，IκB-α表达增强，提示四大血可能抑制了NF-κB信号通路的活化。本研究提示四大血可明显改善CIA大鼠相关症状，而这可能与抑制NF-κB的活化过程，降低IL-17表达，而下降的IL-17又进一步抑制NF-κB的活化，由此形成的良性循环有关。但是本研究结果仅仅是初步提示，关于其具体影响信号转导通路的机制仍不明确，还有待后期进一步研究。