OPS 玻璃化冷冻对小鼠四倍体胚胎体外发育的影响

谢 璐，徐志远，张 鲁，吕文发，刘国世*

（1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118；2.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）

四倍体胚胎在正常发育过程中只发育为胚外组织（如滋养层、卵黄囊膜、尿囊膜、胎盘等）[1]，而胚胎干细胞（ES 细胞）是具有自我更新和多向分化潜能的胚胎细胞，具有向机体各种组织细胞分化的能力。如果将二者聚合形成嵌合体，其发育能力互相补偿，可得到几乎完全由ES 细胞发育而来的个体，这种技术被称为四倍体补偿技术，又被称为两步克隆法[2]。目前，四倍体补偿技术在ES 细胞全能型的鉴定、生产转基因动物上应用十分广泛，使用基因修饰的ES 细胞产生具有生殖系传递能力的嵌合体是新小鼠模型建立的重要方式[3-5]；且四倍体补偿技术相比于体细胞核抑制而言，操作简便、效率高、获得转基因动物时间短，在ES 细胞上进行基因编辑也较容易[6-7]。嵌合体为研究细胞谱系和分析突变小鼠的复杂表型及研究胚胎发育机理提供了强有力的工具[8]，因而四倍体胚胎的制备及储存显得尤为重要。本研究利用开放式拉长细管（OPS）玻璃化冷冻法对四倍体胚胎进行冷冻，解冻后进行培养，通过观察囊胚率等对四倍体胚胎发育情况和发育所用时间进行评估，以期在四倍体补偿技术中嵌合体制备时提高四倍体胚胎的利用率，便于四倍体胚胎的储存和运输。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6 周龄CD-1 母鼠50 只（中国军事医学科学院实验动物中心）于鼠房适应性饲养1 周，自由采食（军事医学科学院实验动物中心生产全价营养颗粒饲料）和饮水。光控周期为08:00—20:00，室内温度为20～22℃。

1.1.2 实验试剂 体外操作液M2 液；体外培养液M16液；电融合液：0.3 mol/L 甘露醇溶液；预处理液：10%乙二醇液；解冻液：0.5 mol/L 蔗糖溶液；玻璃化冷冻液：先向7 mL 的mPBS 中添加0.3 g/mL 聚蔗糖和0.5 mol/L 蔗糖，而后加入1.5 mL 乙二醇，摇匀，边轻摇边滴入1.5 mL 的二甲基亚砜（DMSO），存于4℃备用。试剂若无特殊说明，均购自Sigma aldrich 公司。

1.1.3 实验仪器 电融合仪，CO2培养箱，体式显微镜，超净工作台，荧光正置显微镜。

1.2 方法

1.2.1 细胞胚胎收集 对20～25 g 的雌性CD-1 小鼠于19:00 注射孕马血清促性腺激素（PMSG）10 IU，48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）10 IU，继而与雄鼠以1∶1 比例合笼。第2 天08:00 检查阴道栓，见栓后第2 天19:00 颈部脱臼法处死受孕雌鼠，冲洗输卵管并收集2-细胞胚。在体式显微镜下挑选正常2-细胞置于M2 液中。

1.2.2 电融合法制作四倍体胚胎 将电融合液加入电融合槽内，将2-细胞胚用电融合液洗涤3 次后移入电融合槽的两电极间。用细玻璃针尖端调整胚体接触面与电场方向垂直。3 V 交流电排序，调节直流脉冲电压至50 V。按下脉冲触发开关2 次，2 次间隔时间为35 μs，处理后用M2 液洗涤胚体2 次，移入M16 液中培养，30～60 min后观察，弃去未融合胚胎，已融合胚胎继续培养。

1.2.3 制作OPS 选用0.25 mL 的塑料细管，在酒精灯烧热后迅速拉伸制成OPS 细管，管壁厚度在0.01～0.02 mm、管壁内径为0.10～0.20 mm、管壁外径18～22 mm，用刀片断开，最终使OPS 细管的长度保持在22～26 mm。

1.2.4 四倍体胚胎的玻璃化冷冻 冷冻前2 h 将室温调至（25±0.5）℃，将所用溶液在37℃预热。冷冻时将四倍体胚胎移入预处理液中平衡30 s，再转入冷冻液中处理25 s。继而立刻将四倍体胚胎及少量冷冻液吸入OPS 中，标记投入液氮并保存。

1.2.5 四倍体胚胎细胞的解冻 从液氮中取出装有冷冻四倍体胚胎的OPS 管，迅速浸入放置在37℃恒温台体视镜下的解冻液中，解冻后立即将四倍体胚胎移入新配制的解冻液中平衡5 min。继而于磷酸缓冲液（PBS 液）中洗涤1 遍，然后将四倍体胚胎移入M16 培养液置于培养箱内恢复1 h，继续培养。

1.2.6 解冻后四倍体胚胎的观察 设置3 个实验组：二倍体胚胎对照组（2N 对照组），即二细胞（2-C）胚胎不进行电激；四倍体胚胎未冷冻组（4N 新鲜组），即2-C 电激1 次后发生融合，四倍体胚胎发育到早期囊胚不进行冷冻；四倍体胚胎冷冻组（4N 冷冻组），即2-C电激1 次后发生融合，四倍体胚胎发育到早期囊胚进行冷冻。分别观察各组的囊胚数、完全孵化囊胚数，统计囊胚率和孵化囊胚率。分别观察4N 新鲜组和4N 冷冻组在解冻的四倍体胚胎继续向囊胚发育的过程，从各组第1 枚早期囊胚出现开始，每隔半小时记录各组发育至囊胚腔直径达到三分之二、可满足后期注射要求的囊胚个数，统计各组完全发育为囊胚腔直径达到三分之二的囊胚所用时间。

1.2.7 囊胚细胞数染色计数 细胞核荧光标记计囊胚细胞数，将囊胚在含4%多聚甲醛的DPBS 中固定10 min。而后把固定好的囊胚转移到Hochest 染液中避光染色10 min，再用含0.1% PVA 的PBS 洗3 遍，将囊胚放到载玻片上，临时封片，盖上盖玻片后在荧光正置显微镜下观察细胞数。

1.3 统计分析 采用SPSS 22.0 软件处理数据，计数资料比较采用单因素方差分析，均值的多重比较采用Duncan´s 进行，结果用平均值±标准误表示，P＜0.05时为差异显著。

2 结 果

2.1 OPS 玻璃化冷冻解冻后四倍体胚胎的发育能力 由表1 可见，电融合后4N 新鲜组的囊胚率、孵化囊胚率均与2N 对照组差异不显著；4N 冷冻组囊胚率与4N 新鲜组差异不显著，但4N 冷冻组孵化囊胚率较高，显著高于4N 新鲜组。

2.2 冷冻对四倍体胚胎囊胚细胞数的影响 如图1 和表2 所示，与2N 新鲜组相比，4N 新鲜组的囊胚细胞数约减半（P＜0.05）。4N 冷冻组的囊胚细胞数与4N 新鲜组无显著差异。

2.3 冷冻后四倍体胚胎发育至满足注射要求所需时间如图2 所示，与4N 新鲜组相比，4N 冷冻组胚胎都发育到适合用于注射囊胚的所需时间较少（P＜0.05），其发育速度相对更快更为集中。

表1 解冻后四倍体胚胎冷冻组和二倍体、四倍体新鲜组的发育情况

图1 各组囊胚细胞染色代表图（标尺：100 μm）

表2 解冻后四倍体囊胚和各未冷冻组囊胚的囊胚细胞数

图2 各组全部发育至囊胚腔直径达到三分之二的囊胚所用时间

3 讨 论

四倍体胚胎的常用制作方法有3 种：一是物理注射法；二是利用化学试剂抑制卵裂球分裂法，一般使用的化学试剂是细胞松弛素 B（Cytochalasin，CB）和秋水仙素等[9]；三是卵裂球融合法，仙台病毒、化学试剂和电刺激都可使细胞发生融合[10]。电刺激融合法制备四倍体细胞相较其他方法而言，无毒副作用，操作更为简捷，融合效率更高。因而，本实验选择采用电融合法制备四倍体细胞，共有231 枚二细胞参与电融合，融合222 枚，电融合效率为96.1%。融合后的四倍体胚胎后期发育囊胚率和孵化囊胚率与二倍体胚胎相比无明显差异，电融合法制备四倍体胚胎对胚胎前期的发育无显著影响。观察其发育过程，新鲜四倍体胚胎的囊胚细胞数为新鲜二倍体胚胎的一半左右；冷冻后四倍体胚胎的囊胚细胞数与新鲜四倍体差异不显著，4N 冷冻组和新鲜组仅是囊胚细胞数减半，形态上与二倍体并无区别。

OPS 玻璃化冷冻是目前最常用的一种便捷快速的降温方式，已广泛应用于小鼠等哺乳动物的卵母细胞及早期胚胎的冷冻[11-12]，但对小鼠四倍体胚胎的冷冻却鲜有报道。本实验用OPS 玻璃化冷冻法对小鼠四倍体胚胎进行冷冻操作，实验结果显示冷冻对囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响，可显著提高四倍体胚胎的孵化囊胚率，说明OPS 玻璃化冷冻并不会降低四倍体胚胎的发育潜能。四倍体胚胎制作成功之后可进行冷冻储存，实验中可根据受体鼠数量解冻相应数量的四倍体胚胎，在一定程度上避免浪费，同时节省人力物力。嵌合体胚胎在制作过程中非常繁琐，用囊胚注射法制作嵌合体胚胎时需要挑选囊胚，只有当囊胚腔直径达到三分之二后的一段时间内才适合注射。操作过程中会有大部分囊胚由于发育阶段不符合要求被放弃，原因是胚胎的发育速度快慢不一，跨度较久。

观察四倍体胚胎解冻之后培养，这些胚胎均在2～3 h内发育成囊胚腔直径达到三分之二的阶段，与对照组相比发育速度较快、发育阶段比较集中。温度和机械刺激、能量状态、激素、生长因子、pH 以及抗氧化物等外在因素均能影响胚胎发育速率[13]，冷冻过程会影响胚胎生化活动和新陈代谢速率，冷冻解冻后依然能保持胚胎染色质完整性[14]，可能使胚胎发育中各胚层的发育速率略有调整，最终使得发育速率更为集中。因此，大部分囊胚都能用于注射，减少了四倍体胚胎的浪费，在大量积累了冷冻的四倍体早期囊胚后，可进行连续移植，提高嵌合体胚胎制作时注射和移植的效率。

4 结 论

本实验通过电融合法制得四倍体胚胎，利用OPS玻璃化冷冻法对四倍体胚胎进行冷冻。解冻后对其发育情况进行观察发现，OPS 玻璃化冷冻可显著提高四倍体胚胎的孵化囊胚率，且发育速度更快。冷冻可作为四倍体胚胎储存、运输的有效手段，提高嵌合体胚胎制作的效率。