两种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂的检验重复性与一致性比较

2019-07-16 08:30华燕美
肝脏 2019年6期
关键词:罗氏操作者重复性

华燕美

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)不仅可引起人类急、慢性肝炎,还能进展为肝硬化,甚至是肝癌,并且肝癌死亡率较高[1-2]。研究发现,HBV DNA持续复制水平越高,发生肝癌的可能性就越大[3]。因此,评价乙型肝炎治疗效果和预后最重要也是最直观的方法就是检测HBV核酸定量检测[4-5]。目前, 国内出现了一系列商品化HBV核酸检测试剂盒,但其与国外进口原装试剂盒之间的性能差异尚不明确。因此,本文选择了罗氏原装与国产乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒进行了重复性与一致性比较。

资料与方法

一、样本来源

使用WHO HBV DNA标准品,先用0.5mL去离子水溶解,再用阴性人血清梯度稀释至所需滴度,HBV DNA 滴度分别为60、170、1 700、17 000 IU/mL,每个滴度检测20次。收集2016 年8月—12月在我院正在接受乙肝抗病毒治疗的患者或复诊患者血清,HBV DNA 载量为<50、50~200、~102、~103、~104、~105、~106、~107、~108 IU/mL,每组10例,年龄29~57岁,样本抗-HAV、抗-HCV、抗-HEV均为阴性。

二、研究方法

HBV核酸定量检测罗氏试剂使用平台:cobasAmpliPrep/cobasTaqMan,采用罗氏HBV DNA定量检测试剂盒(灵敏度20 IU/mL,线性范围20~1.7×108IU/mL),严格按照说明书进行操作。国产试剂使用平台:核酸提取仪DP1 000、Cobas Z480实时荧光定量PCR仪,采用国产乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(灵敏度50 IU/mL,线性范围50~5.0×108IU/mL),严格按照说明书进行操作。大致步骤如下:采用磁珠法进行提取HBV DNA后,然后进行低速离心,将样品加入到定量PCR仪中, 50℃反应2min,在94℃下进行保温5 min,进行94℃ 10 s~60℃ 45 s循环,完成40个循环,60℃采集荧光通道信号,并计算各样本HBV DNA含量(IU/mL)。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。单因素方差分析(ANOVA)检测操作者间或操作者内差异,计算组内相关系数(ICC)判断组内一致性。计算两者间相关系数R,进行Bland-Altman图绘制。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

结 果

一、 两种试剂的溯源性和重复性

3名操作者分别对WHO标准HBV DNA样品(17 000 U/mL)进行检测:罗氏检测测结果分别为(1.66±0.13)、(1.68±0.21)、(1.66±0.11)×104IU/mL国产检测结果分别为(1.89±1.51)、(1.62±1.66)、(2.13±1.45) ×105IU/mL。三名操作者间差异无统计学意义(罗氏F=2.59,P>0.05;国产F=2.06,P>0.05),说明不同操作者间重复性良好。

从3名操作者中随机抽取1人,隔日对每一样本重复测量3次,罗氏检测结果分别为(1.66±0.13)、(1.67±0.12)、(1.69±0.13)×105IU/mL,国产检测结果分别为(1.89±1.51)、(1.92±1.71)、(1.74±1.65) ×105IU/mL。同一操作者内操作差异无统计学意义(罗氏F=1.02,P>0.05;国产F=1.16,P>0.05),说明同一操作者不同操作间重复性良好。

两种试剂检测4个滴度(60、170、1 700、17 000 IU/mL)的WHO HBV DNA标准品,每个滴度分别检测24次,均值及SD见表1。罗氏检测试剂ICC值为0.93(F=12.51,P<0.0001),国产检测试剂ICC值为0.82(F=8.72,P<0.0001),罗氏检测试剂组内重复性优于国产试剂。

表1 两种HBV DNA定量重复检测HBV DNA 标准品结果(以对数形式表示)

二、两种试剂的一致性

两种试剂检测9组不同HBV DNA滴度的患者血清样本,每组10例,结果进行相关性分析,两者相关系数r=0.849,P<0.0001,相关性良好(图1)。两组临床血清检测的Bland-Altman图,可见两种检测试剂结果差值90%的位点位于95%置信区间参考范围内,说明两种检验方法间一致性良好(图2)。

图1 两种乙型肝炎病毒核酸检测试剂检测结果的相关图

注:虚线代表Y=0,其他三条线分别代表Y=两种方法差值均数,Y=两种方法差值均数+1.96SD;以及Y=两种方法差值均数-1.96SD。

图2两种乙型肝炎病毒核酸检测试剂差异Bland-Altman图

讨 论

HBV DNA的病毒载量通常被认为是衡量HBV 复制情况的“金标准”[6-8]。HBV DNA的定量检测是检测病毒拷贝数最直接、最可信赖的方法,可以帮助确诊隐性HBV感染和隐性慢性乙型肝炎,并对乙肝活动期患者的病毒监控提供临床指导意义[9-11]。目前,在我国检测乙型肝炎病毒核酸定量的检测试剂盒种类繁多,除了最经典的罗氏原装进口试剂盒外,还有国产试剂盒生产商包括湖南圣湘、上海科华等等。由于不同HBV检测试剂可能会带来不同的结果[12],这使得检验报告不能给医生的临床治疗带来有效的指导,也使得不同实验室之间无法互认,出现交流障碍。因此,对不同检验试剂进行重复性与一致性评价,并分析之间的相关性具有重要的临床意义。

本课题组选择了罗氏原装与国产乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂进行了WHO标准HBV DNA样品和患者血清样本检测,结果发现罗氏检测结果更接近于真实值,数值波动程度小。3名操作者间差异无统计学意义,说明不同操作者间重复性良好。同一操作者内操作差异无统计学意义,说明同一操作者不同操作间重复性良好。而组内一致性检测发现罗氏试剂ICC值为0.88(P<0.01),国产试剂为0.74(P<0.01),证实了罗氏检测试剂重复性优于国产试剂。这可能是因为国产和进口试剂盒在病毒载量损耗和试剂制备方面的不同,影响了定量检测结果的重复性。类似的是,有学者报道国产试剂盒在产品的整体设计上已基本达到国外同类产品水平,但实际上灵敏度及检测下限方面却有着较大波动[13-14]。因此,国产HBV DNA定量检测试剂仍需进一步改进并提高检测质量。

本课题组进一步进行了相关性分析,发现两者相关系数r=0.849,P<0.0001,相关性良好(图1)。而Bland-Altman图可见两种检测试剂结果差值90%的位点位于95%置信区间参考范围内,说明两种检验方法一致性良好(图2)。由此可见,虽然国产试剂重复性低于罗氏原装进口试剂盒,但两者检测结果一致性较好,说明国产HBV DNA定量检测试剂作为一种廉价高效检测手段具有良好的应用前景,可以在贫困偏远地区进行普查或者临床上进行辅助使用。在需要对结果进一步精确测定时应选择罗氏原装试剂,是临床应用的“金标准”。利用罗氏原装试剂作为统一的标准进行评价和监测,可以实现HBV DNA定量测定结果的一致,保证为临床医生质量提供指导的准确性。

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