视网膜母细胞瘤斑马鱼模型及rb1基因研究进展

王俐梅, 张 建, 刘忠华, 杨 威

(1. 广东省生物资源应用研究所, 广东省动物保护与资源利用重点实验室,广东省野生动物保护与利用公共实验室, 广州510260;2. 华南农业大学兽医学院, 广州510642; 3. 广州医科大学基础医学院, 广州 511436;4. 广东莱恩医药研究院有限公司, 广东省药物非临床评价研究企业重点实验室, 广州 510990)

视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma, RB)是一种常见的发生于婴幼儿眼内的原发恶性肿瘤[1,2]。目前RB发病的机制主要包括染色体遗传、染色体突变、病毒感染等。对于RB发生的共识性观点是： 由视网膜母细胞中rb1双等位基因突变引发RB蛋白磷酸化缺陷, RB蛋白活性的丧失导致细胞周期受损和细胞增殖失控引起的[3], RB蛋白是参与细胞周期发展、终末分化和DNA复制的主要肿瘤抑制基因[4-6]。世界卫生组织[7]统计表明, RB发病率较低, 全世界平均每16 000～18 000新生儿中只有1例发生RB, 但我国RB患儿的生存率仅为63%, 远低于发达国家95%的生存率, 因此我国对于RB的研究亟待加强。

虽然RB的发病率较低，但RB的治疗在世界范围内仍然是一个难题，为保住患者生命，往往只能采取眼球摘除或者眼眶内容剜出术。尽管大多数RB患儿存活下来，但他们通常会永久失去视力，因此如何在治愈肿瘤的同时保住眼球和视力成为研究目标，早发现、早诊断是避免手术治疗RB疾病的最佳途径。近几年基因检测和编辑技术快速发展，共识性的观点是在不远的未来，人类有可能通过基因编辑的方法治疗疾病。最近研究[7-11]表明，现有分子生物学及分子遗传学方法已经能够实现rb1基因突变检测。我国在相关研究方面也有明显进展，孟庆娱等[12]利用基因捕获技术成功筛选出了视网膜母细胞瘤患者的rb1突变基因，兰小平等[13]采用Sanger测序与多重连接探针扩增技术相结合的策略探索了母系遗传性视网膜母细胞瘤家系rb1基因分析与产前诊断。

成功构建RB动物模型是进一步开展相关研究的必备条件，传统的模式动物在发挥重要作用的同时，基因编辑相关的科学研究从实验便利性、繁殖率、繁殖速率和成本等方面对模式动物提出了新的需求，在这样的背景下斑马鱼以其独特的优点，已经成为了一种引发广泛关注的新兴模式动物。

1 RB斑马鱼模型与其他动物模型的比较分析

斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio)与人类基因同源性高达85%，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，且斑马鱼具有饲养成本低、体积小、发育周期短、体外受精、透明易观察和单次产卵数较高等优点[14]。目前斑马鱼已被美国国家卫生研究院(NIH)列为继人和小鼠之后的第三大模型动物。基于以上显著优点，斑马鱼已经应用于以下几个癌症研究领域： ①使用化学致癌, 遗传和异种移植的方法建立癌症模型; ②用评估肿瘤血管生成; ③研究肿瘤转移; ④抗肿瘤药物筛选和药物毒性评价[15,16]。 RB发病机制研究及治疗药物的研发都需要合适的动物模型。已经报道[17-25]可以用于构建RB模型的动物有小鼠、大鼠、兔、非洲爪蟾、斑马鱼等, 以上动物模型存在各自的优缺点。本文对现有RB动物模型的总结见表1。

虽然斑马鱼RB模型研究尚处于起步阶段，但已经有了较多的发现。最近研究[29]表明，通过斑马鱼模型可以从单个细胞水平上监测到标记后的RB细胞的侵袭和转移过程，且实现了实时动态监测，从而为肿瘤侵袭、转移和药物作用的相关研究提供了一个新的思路。本文将综述现有的RB斑马鱼模型的建立方法以及基于这些模型取得的研究进展，以促进RB相关的研究。

2 构建RB斑马鱼模型的方法

2.1 异种移植RB斑马鱼模型

Hyun 等[25]建立了一种异种移植RB斑马鱼模型,具体做法是： 在斑马鱼卵受精48 h后, 将RB细胞注入斑马鱼胚胎的玻璃体腔。由于斑马鱼胚胎很小且具有光透明性，在胚胎期可以利用共聚焦激光显微镜对斑马鱼的眼球成像，进而能够通过图像中绿色荧光蛋白(GFP)的强度定量地分析肿瘤细胞群。在不使用药物的情况下随着注射的RB细胞数量增加,眼球中GFP强度增强, 预示着肿瘤群体变大。将斑马鱼模型饲养在含有药物Carboplatin和Melphalan的林格氏液中, 结果显示特定浓度的药物Carboplatin和Melphalan能够分别降低GFP的表达强度30%和28%,这个结果预示斑马鱼模型可以用于筛选抗癌药物。

表1 RB动物模型建模方法和特点分析Table 1 Modeling methods and characteristics of animal models of retinoblastoma

Chen等[26]建立了另一种类型的异种移植RB斑马鱼模型，方法是：将红色染料标记的人RB细胞(RB355)和小鼠(SJmRBL-8)细胞植入斑马鱼胚胎的玻璃体内，所使用的斑马鱼的血管内皮细胞能够表达GFP。由于采用了双色标记, 能够看到肿瘤细胞和周围微血管之间的相互作用，肿瘤细胞附着于血管形成簇, 先是关联增强, 然后关联减少, 说明微血管系统可能是肿瘤侵袭的结构基础。进一步使用药物Vegf-aamorpholino和Sunitinib对含有RB的斑马鱼胚胎进行了治疗, 结果表明药物Vegf-aamorpholino和Sunitinib能够显著降低转移细胞的数量和头部肿瘤直径，说明这两种药物显著减弱了肿瘤细胞的侵袭和转移。以上结果预示着斑马鱼模型可以用于侵袭性疾病的治疗研究。

2.2 基因突变RB斑马鱼模型

Gyda等[27]报道了一种自发性rb1基因突变的斑马鱼。他们首先对基因突变斑马鱼使用PCR方法进行基因序列分析，然后用染料DiI 或DiO对视网膜神经节细胞进行标记，接着通过免疫组织化学方法判断视网膜神经节细胞在细胞周期中的延迟情况。由于视网膜神经节细胞中可以表达GFP荧光，因而通过共聚焦显微镜观察视网膜构造轨迹，可以推断出轴突发展的情况。通常情况下，新生野生型斑马鱼胚胎视网膜神经节细胞的轴突先于视网膜引背盖形成，而本研究结果显示rb1突变后的斑马鱼，视网膜神经节细胞分化周期出现了延迟，导致视网膜神经节细胞短暂不足，进一步导致视网膜神经节细胞的轴突缺陷，从而引发视网膜连接异常和趋势行为缺陷，使视神经发育不全。尽管 rb1突变的斑马鱼，能够最终建立基本的网膜连接，但是行为学分析表明，这些发生了rb1突变体的斑马鱼表现出明显的视觉行为障碍。该研究表明这种罕见的rb1基因突变的斑马鱼会形成RB模型，从一种新的视角建立了一种 rb1基因的功能通路。

2.3 TALEN基因编辑RB斑马鱼模型

Solin等[28]使用TALEN基因编辑法构建RB斑马鱼模型，具体方法是：将靶向rb1基因外显子2和3的TALEN mRNA注入胚胎，经过编辑的部分斑马鱼胚胎，在3.5个月时开始生长肿瘤。研究者先通过组织病理学染色对不同的肿瘤进行特点分析，进一步通过免疫组织化学法对肿瘤进行鉴定。结果显示肿瘤发生部位不同，主要出现在大脑中并非视网膜，表现出了神经外胚层样和胶质样肿瘤的特征。该研究验证了斑马鱼 rb1失活会导致癌症，突出了位点特异性核酸酶对于创建基因嵌合斑马鱼的作用，便于研究癌症中的 rb1功能。

Zhang等[29]使用TALEN基因编辑法建立了RB斑马鱼模型, 用于研究 rb1在T细胞发展过程中的作用机制。他们开发的TALEN mRNA能够高效的靶向rb1基因的外显子2，注射入斑马鱼胚胎后导致了F0代80%的等位基因丢失，F1代中得到了缺乏rb1蛋白的突变体。研究表明rb1基因通过抑制E2F1保护T细胞成熟免于过早凋亡。此外，Schultz等[30]也使用TALEN基因编辑法制作斑马鱼模型，并进一步选用诱导产生的大脑肿瘤用于研究，研究表明表观遗传调控因子Rbbp4和Hdac1在斑马鱼rb1胚胎脑肿瘤模型中过表达，是神经祖细胞生存和增殖所必需的。

3 小结

由于我国仍然面临RB疾病较低的治愈率和生存率，对于RB疾病的治疗仍有很大的瓶颈，药物的研发与评价显得尤为重要，而斑马鱼作为新型RB模型为药物研发与评价提供了新的选择和思路。斑马鱼的选择能够大大提高药物研发与评价工作效率, 因此斑马鱼应用于RB模型中有极大的竞争力。

从以上内容可以看出： ①异种移植法构建原位RB斑马鱼模型，优于其他方法，且操作可行性较高，能够获得确切目标的肿瘤模型，评价指标简便; 使用荧光染色等方法能够活体监测肿瘤，有利于进一步用于药物筛选研究。但是在肿瘤发生机制等研究中没有进行深入研究。②基因突变法构建肿瘤模型，揭示了rb1在调节视网膜神经节细胞轴突和视觉行为中的新作用，为鉴定难以捉摸的RB细胞起源提供新的潜力，但是基因突变极少数能获得RB斑马鱼模型，需要进一步研究其机制，此方法目前不适用于RB斑马鱼模型的构建。③TALEN基因编辑法构建肿瘤模型，成瘤不确定，在动物机体内多个部位成瘤，但在视网膜未获得肿瘤，需要进一步研究其机制，不适用于RB斑马鱼模型的构建，但是研究证明了使用基因编辑核酸酶有助于快速大规模筛选斑马鱼中肿瘤抑制因子。

综上所述，RB斑马鱼模型可以为开发防治RB药物的成药性评价提供关键支撑，有助于推进一线治疗药物的转化。同时RB斑马鱼模型的研究工作可以为RB的侵袭、转移及发病机理提供新见解，有助于推进标准化动物模型并建立相应治疗方法。此外, 从实验动物福利和3R原则角度来看, 斑马鱼模型作为低等动物能更好替代高等动物, 有利于对斑马鱼模型进行深入研究，建立更好模型评价标准和药物标准。然而目前RB斑马鱼模型研究尚刚刚起步，异体移植的方法相对比较成功的建立模型和评价指标, TALEN方法操作较为复杂, 模型构建的成功率不是很高, 仍需要进一步深入研究。目前最新的基因编辑技术CRISPR/Cas9还未有用于建立RB斑马鱼模型的研究报道, 但我们相信该技术将在基因修饰RB斑马鱼模型的制备及研究中发挥作用。