应用于行为学研究中八臂迷宫实验方法的改良

刘 波, 王 杨, 李志杰

(1. 中国医科大学附属盛京医院实验研究中心, 沈阳 110004;2. 辽宁省环境与代谢疾病动物模型研究与应用重点实验室, 沈阳 110004;3. 辽宁省肿瘤医院结直肠外科, 沈阳 110042)

八臂迷宫是一种研究动物空间记忆的迷宫模型，主要用于不同药物处理以及疾病模型下动物学习、记忆、觅食策略、空间认知等多方面的研究[1]。它由八边形中央区和与其连接的八条工作臂组成。实验者通过在特定食饵臂末端放入食饵作为对进入该臂的奖赏，而在其余臂内不放食饵或通过刺激手段惩罚实验动物的方式对实验动物进行迷宫觅食训练。动物在饥饿驱使下探索迷宫寻找食饵，通过一定时间的训练后，可对迷宫各臂进行自由探索并成功躲避没有食饵的工作臂完成觅食。通过水，电等刺激-应答模块建立完整的条件、非条件环境刺激，配合视频采集系统记录实验动物觅食或逃避策略，提供灵敏且易于操作的技术以分析不同药物处理或疾病模型损伤对记忆相关脑区的影响，用于评估发育神经损伤处理对啮齿类动物空间学习记忆认知的影响[2]。

目前大多文献采用的传统八臂迷宫实验方法在实际操作中的训练周期长达2～4周。实验动物成功躲避无诱饵臂端快速找到食饵臂端概率较低，且单次探索时间长或是训练次数过多，不能在短时间合理训练频率下有效评估空间学习记忆能力，无法方便服务于实验者快速有效完成实验[2]。为此本实验应用改良电加热条件刺激八臂迷宫装置探索新型八臂迷宫实验方法。

1 材料与方法

1.1 动物

选取清洁级雄性SD大鼠20只，体质量(200±10)g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供[SCXK(辽)2015-0001], 随机分为2组, 对照组10只按照传统八臂迷宫方法进行训练，实验组10只按照改良方法进行训练。实验开始前一周所有大鼠开始控制摄食量，每日定时投喂饲料10 g/只，控制体质量保持在原体质量的80%～85%，饮水不限[SYXK(辽)2017-0004]。并于固定时间对将要进行实验的大鼠实施抚摸安抚以适应环境，并于实验开始前禁食12h。

1.2 仪器设备

视频追踪系统： Ethovision XT 小动物视频轨迹行为学分析系统，购自荷兰Noldus公司; 箱体： 标准大鼠八臂迷宫箱体，尺寸为单臂长425 mm，宽145 mm，高225 mm，购自北京众实科技有限公司; 奖励食饵： 经60Co辐照灭菌的市售生瓜子仁; 惩罚装置： 4个电辅热装置，尺寸100 mm×100 mm，购自江苏省东台市正龙电热电器厂; 参考物： 各臂内贴不同形状参考物(以加强实验过程中动物对周围环境的记忆)。

1.3 实验方法

第1日：让大鼠适应迷宫环境。将禁食12 h的2组大鼠随机各再分为5组，每组2只。将迷宫闸门同时打开并在各臂末端及中央区域各投放5个瓜子仁作为食饵，2只大鼠同时放入迷宫中央区域, 让其自由摄食、探究10 min，每日训练2次。以大鼠后肢完全进入臂门记为进入该臂1次。

第2日：重复第1日的训练。实验人员于训练开始前轻柔安抚动物5～10 min，使其放松地自由探索迷宫环境。

第3日：迷宫及食饵位置保持不变，每只大鼠单独进入迷宫训练，使其大胆独自探索迷宫环境。每只鼠在单次训练结束后用体积分数75%酒精喷洒擦拭箱体以去除气味滞留。

第4日：为对照组大鼠设定特定食饵臂以及空食饵臂，例如1号动物食饵臂1，3，5，6; 空食饵臂为2，4，7，8。实验组大鼠设定固定食饵臂及电加热惩罚臂，例如： 1号动物食饵臂为2，4，5，8; 电加热惩罚臂为1，3，6，7。在每个食饵臂投放1颗瓜子仁作为食饵。电加热惩罚装置温度设定为60 ℃。电加热惩罚臂末只放置电加热装置而不放食饵。实验者将大鼠轻柔地放入至八臂迷宫中央，适应环境30 s后同时打开闸门让其自由探究直至吃完食饵或总探索时间达10 min结束训练，每日训练2次。

第5至第7日；重复第4日的训练。

第8日：连接视频轨迹跟踪采集系统，设定大鼠编号及采集信息，只在对应编号的食饵臂放置1颗瓜子仁作为食饵，而在其他臂中不做任何处理。每只鼠在实验结束后用体积分数75%乙醇喷洒擦拭箱体以去除气味滞留。实验者轻柔地将大鼠放置于迷宫中央，适应环境30 s后同时打开闸门并开始记录其自由探究运动轨迹。软件分析2组大鼠移动距离、移动速度、总体耗时、参考记忆错误以及工作记忆错误等实验指标，以评估两种方法对大鼠空间学习记忆探索能力。工作记忆错误(working memory errors)，即在同一次实验中大鼠再次进入已经吃过食饵的臂; 参考记忆错误(reference memory errors), 即在一次实验中动物进入非食饵臂。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 平均移动距离、探索时间和移动速度

分析第8日采集的视频轨迹可知，与对照组相比，实验组完成实验的平均移动距离和平均探索时间差异有统计学意义(P＜0.01)，而平均移动速度差异无统计学意义(P＞0.05)(表1)，表明本实验中使用的加热装置不会对其运动能力造成影响。

2.2 参考记忆错误和工作记忆错误百分比

分析2组大鼠第8日采集视频轨迹可知，与对照组相比，实验组完成实验的参考记忆错误百分比存在极显著差异(P＜0.01)且小于15%达到训练标准。而工作记忆错误百分比无显著差异(P＞0.05)(表2)。

2.3 第7日训练结果

在训练第7日，2组大鼠均能在10 min内成功完成探索任务。但对照组大鼠完成探索所需时间明显长于实验组。

表1 平均移动距离、探索时间和移动速度

表2 探索过程的参考记忆错误和工作记忆错误百分比

2.4 运动轨迹图

通过视频轨迹跟踪系统轨迹(图1)可见，对照组大鼠在传统方式训练7 d后无法达到八臂迷宫实验追踪测试标准，而实验组大鼠在改良实验方法训练7日后均达到八臂迷宫实验追踪测试标准。

图1 两组实验动物运动轨迹图

3 讨论

八臂迷宫又称放射性迷宫，该装置已广泛应用于检测药物作用或疾病模型损伤下啮齿类动物大脑空间学习记忆能力[3]。八臂迷宫实验准确敏感地反映脑空间学习记忆功能，使其成为检测啮齿类动物空间记忆的重要实验方法之一。空间记忆又分为参考记忆和工作记忆。工作记忆属于程序性记忆范畴，是在皮层-纹状体系统调控下完成的对进行中工作任务的重要信息的短期存储；参考记忆则是空间定位物体本身以及物体与食饵的相对关系[4]。海马结构在短期记忆向长期记忆转变和空间学习记忆功能中发挥至关重要作用[5]。

实验者可通过分析实验动物运动轨迹参数，客观反映实验动物在不同处理条件下特定脑区空间分离记忆能力[6]。然而参考国内外诸多文献[2,3,11]表明，八臂迷宫实验操作目前没有标准统一的工作流程。想要达到最终追踪测试标准即工作记忆错误和参考记忆错误均小于15%，通常需要2～4周甚至更长时间。本实验中，对照组大鼠在训练7d后虽然能在10 min内完成实验探索，但参考记忆错误(平均值41.56%)远超15%的要求。证明传统训练方式无法在7 d内使大鼠达到最终测试标准。所以非常需要有针对大鼠行为特点的新型训练设备和相对规范的操作流程。

本实验创新性采用在无食饵臂增加电加热设备刺激大鼠足底的改良八臂迷宫实验方案。并且通过实验证明相对于传统方法，此方案能在连续7 d的训练过程中使大鼠在八臂迷宫中快速准确完成觅食活动。实验结果对比中表明，两组大鼠均能对陌生的八臂迷宫环境进行自主探索觅食。在分析觅食策略中发现，应用改良实验方法在相同训练时间内能显著缩短觅食运动平均移动距离和探索时间, 更好体现动物进化中优先选择食饵策略。分析两组大鼠平均运动速度可知，改良实验中60 ℃的足底热刺激对大鼠运动能力无明显影响。证明相对于其他水、光、电强刺激, 合理温度的热刺激更能降低受试动物的应激概率，以免出现实验动物因过于恐惧停止探索或强刺激作用下的恐惧情绪对空间记忆形成影响等所致实验失败现象[2]。除此之外，与对照组相比，实验组大鼠参考记忆错误百分比有极显著降低，证明改良实验方法有利于增强大鼠对食饵臂和非食饵臂空间记忆。有趣的是, 两组实验结果中工作记忆错误百分比无统计学意义，提示改良实验方法对实验动物短时记忆无显著影响, 再次表明此方案中的热刺激条件不会造成实验动物的应激反应。

综上所述，本实验采用改良电加热八臂迷宫设备配合参考诸多国内外权威文献及多次实验的改进，形成的实验操作流程能在训练7 d后完成检测大鼠空间学习记忆的八臂迷宫实验。相比于传统实验方法，改良迷宫设备造价低廉，价格优势明显，且操作流程简单易学，并能显著缩短迷宫训练周期，为更好评价实验动物空间分离记忆功能检测提供新方案。