支气管肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测在临床肺癌诊断中的应用

林列坤　卢春生　郑义　杨菊红　邹继彬　王一娜　谭鸿熙

【摘要】 目的 探討支气管肺泡灌洗液中人矮小同源盒基因2（SHOX2）、RAS相关区域家族1A（RASSF1A）基因甲基化检测在肺癌诊断中的应用效果。方法 202例呼吸科住院患者， 其中33例经组织病理诊断肺癌患者， 169例肺部良性结节疾病患者， 收集所有患者支气管肺泡灌洗液， 然后修饰纯化脱氧核糖核酸（DNA）， 进行SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测， 观察其肺泡灌洗液SHOX2、RASSF1A基因甲基化诊断肺癌敏感性、特异性及诊断准确率， 并比较SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测与细胞学诊断肺癌敏感性， 比较SHOX2联合RASSF1A基因甲基化与细胞学诊断肺癌病理学四期敏感性。结果 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化诊断敏感性为87.88%， 特异性为89.35%， 诊断准确率为89.11%。肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化诊断敏感性为81.82%， 特异性为93.49%， 诊断准确率为91.58%。SHOX2、RASSF1A基因甲基化诊断肺癌敏感性分别为87.88%（29/33）、81.82%（27/33）， 均高于细胞学的54.55%（18/33）， 差异具有统计学意义（P<0.05）。SHOX2联合RASSF1A基因甲基化诊断Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分别为75.00%（6/8）、94.12%（16/17）、83.33%（5/6）、100.00%（2/2）， 细胞学诊断Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分别为37.50%（3/8）、52.94%（9/17）、66.67%（4/6）、100.00%（2/2）， SHOX2联合RASSF1A基因甲基化诊断Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肺癌的敏感性均高于细胞学诊断。其中SHOX2联合RASSF1A基因甲基化诊断Ⅱ期肺癌的敏感性高于细胞学诊断， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 支气管肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测有助于肺癌的早期诊断， 可以作为新型的肿瘤分子标志物。

【关键词】 人矮小同源盒基因2;RAS相关区域家族1A;甲基化;肺癌

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.18.001

Application of detection of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in bronchoalveolar lavage fluid for the diagnosis of clinical lung cancer   LIN Lie-kun， LU Chun-sheng， ZHENG Yi， et al. University of Chinese Academy of Sciences Shenzhen Hospital， Shenzhen 518106， China

【Abstract】 Objective   To discuss the application effect of detection of short stature homobox 2 （SHOX2） and RAS association domain family1A （RASSF1A） gene methylation in bronchoalveolar lavage fluid for the diagnosis of clinical lung cancer. Methods   There were 202 hospitalized patients in respiratory department， including 33 cases of lung cancer diagnosed by histopathology and 169 cases of benign pulmonary nodule disease. The bronchoalveolar lavage fluid was collected from all patients， and then modified and purified deoxyribonucleic acid （DNA） was used to detect the methylation of SHOX2 and RASSF1A genes. The sensitivity， specificity and diagnostic accuracy of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in alveolar lavage fluid for the diagnosis of lung cancer was observed. The sensitivity of SHOX2， RASSF1A gene methylation detection and cytological diagnosis of lung cancer were compared， and the sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation and cytological diagnosis of lung cancer pathological stage 4 were compared. Results  The sensitivity， specificity and accuracy of SHOX2 gene methylation in alveolar lavage fluid were 87.88%， 89.35% and 89.11% respectively. The diagnostic sensitivity， specificity and accuracy of RASSF1A gene methylation in alveolar lavage fluid were 81.82%， 93.49% and 91.58% respectively. The sensitivity of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in the diagnosis of lung cancer was 87.88% （29/33） and 81.82% （27/33）， respectively， which were higher than 54.55% （18/33） of cytology （P<0.05）. The sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation in the diagnosis of stage Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ lung cancer was 75.00% （6/8）， 94.12% （16/17）， 83.33% （5/6） and 100.00% （2/2）， respectively. The sensitivity of cytological diagnosis of stage Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ lung cancer was 37.50% （3/8）， 52.94% （9/17）， 66.67% （4/6） and 100.00% （2/2）， respectively. The sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation in the diagnosis of stage Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ lung cancer was higher than that of cytological diagnosis. The sensitivity of SHOX2 combined with RASSF1A gene methylation in the diagnosis of stage Ⅱ lung cancer was higher than that of cytological diagnosis （P<0.05）. Conclusion   Detection of SHOX2 and RASSF1A gene methylation in bronchoalveolar lavage fluid is helpful for early diagnosis of lung cancer and can be used as a new molecular marker of cancer.

【Key words】 Short stature homobox 2; RAS association domain family1A; Methylation; Lung cancer

肺癌是全球发病率和死亡率最高的肿瘤之一， 病死率在各类肿瘤中居首位， 我国由于社会人口老龄化加剧， 加之吸烟、大气污染等因素影响， 我国肺癌的发病问题更加突出[1]。据我国癌症中心数据报道， 我国每年新发肺癌病例78万， 其中死亡病例70万。同时， 由于肺癌早期症状不明显， 患者就诊晚， 往往错过最佳诊断治疗时机， 致使肺癌的发病率及病死率均呈上升趋势[2]。目前临床检测肺癌的金标准为病理学检查， 由于早期肺癌（原位和ⅠA期肺癌）多位于直径1 cm的结节内， 大多很难取得活体组织标本明确病理诊断。其他诊断方法有X射线、支气管镜检查、螺旋CT和细胞学检查， 但均存在着较高的漏诊率及敏感性较差的特点。由于缺乏有效的筛查和诊断手段， 只有14%的早期肺癌能被诊断， 5年生存率仅为16%， 因此， 早期有效准确的筛查和诊断肺癌， 是临床面临的迫切问题。目前， DNA甲基化修饰在肿瘤形成的早期即发生， 是很多肿瘤的里程碑事件[3]。本文通过对支气管肺泡灌洗液中SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测， 探讨SHOX2

和RASSF1A基因甲基化对肺癌诊断的作用， 现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选择2018年1月～2019年2月本院202例呼吸科住院患者， 其中33例经组织病理诊断肺癌患者， 男24例， 女9例;年龄42～72岁;包括鳞癌19例， 腺磷癌3例，

腺癌7例， 小细胞癌4例;Ⅰ期8例， Ⅱ期17例， Ⅲ期6例， Ⅳ期2例。169例肺部良性结节疾病患者， 男108例， 女61例;年龄35～79岁;包括支气管扩张22例， 慢性阻塞性肺疾病38例， 肺炎89例， 肺部占位肿物20例。

1. 2 试剂与仪器 试剂：上海透景生物科技有限公司提供， 严格按说明书操作。仪器：ABI7500全自动荧光聚合酶链式反应（PCR）仪。

1. 3 研究方法

1. 3. 1 支气管肺泡灌洗液收集 术前交代患者纤维支气管镜检查目的、注意事项并签署检查同意书。先行术前准备， 然后所有患者均予以纤维支气管镜经鼻插入， 先检查左右支气管， 并根据患者胸部CT显示的病变部位， 将纤维支气管镜远端楔于病变所在的段支气管开口处， 弥漫病变则冲洗右中叶或左舌叶， 注入37℃温生理盐水， 20 ml/次， 灌洗2次， 以13 kPa负压尽可能吸尽灌洗液， 收集约10～20 ml肺泡灌洗液， 2000 r/min离心5 min， 弃上清， 留500 μl左右含脱离细胞液体， 再加入500 μl细胞保存液， 混匀， 2000 r/min离心5 min， 弃上清， 余500 μl于2～8℃保存待检。

1. 3. 2 操作过程 标本采集→DNA提取， 亚硫酸盐修饰→修饰后DNA纯化→实时荧光PCR检测→分析判断结果。肺泡灌洗液提取DNA后要求：OD260/OD280：1.6～2.0;DNA浓度≥10 ng/μl。

1. 4 观察指标 观察肺泡灌洗液SHOX2、RASSF1A基因甲基化诊断敏感性、特异性及诊断准确率， 并比较SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测与细胞学诊断肺癌敏感性，  比较SHOX2联合RASSF1A基因甲基化与细胞学诊断肺癌病理学四期敏感性。

1. 5 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化检测情况 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化诊断敏感性为87.88%， 特异性为89.35%， 诊断准确率为89.11%。见表1。

2. 2 肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化检测情况 肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化诊断敏感性为81.82%， 特異性为93.49%， 诊断准确率为91.58%。见表2。

2. 3 SHOX2、RASSF1A基因甲基化与细胞学诊断肺癌敏感性比较 SHOX2、RASSF1A基因甲基化诊断肺癌敏感性分别为87.88%（29/33）、81.82%（27/33）， 均高于细胞学的54.55%

（18/33）， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见图1。

图1 SHOX2、RASSF1A基因甲基化与细胞学诊断肺癌敏感性比较结果柱状图

2. 4 SHOX2联合RASSF1A基因甲基化与细胞学诊断肺癌病理学四期敏感性比较 SHOX2联合RASSF1A基因甲基

化诊断Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分别为75.00%（6/8）、94.12%（16/17）、83.33%（5/6）、100.00%（2/2）， 细胞学诊断Ⅰ、Ⅱ、

Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分别为37.50%（3/8）、52.94%（9/17）、66.67%（4/6）、100.00%（2/2）， SHOX2联合RASSF1A基因甲基化诊断Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肺癌的敏感性均高于细胞学诊断。其中SHOX2联合RASSF1A基因甲基化诊断Ⅱ期肺癌的敏感性高于细胞学诊断， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见图2。

图2 SHOX2联合RASSF1A基因甲基化与细胞学诊断肺癌病理学四期敏感性比较结果柱状图

3 讨论

SHOX2称为人矮小同源盒基因2， 是同源盒基因的一员， 其基因序列还有两个CpG岛[4]。研究发现， SHOX2基因在多种实体肿瘤中表达异常， 如肺癌、乳腺癌和肾癌[5， 6]。有研究显示， 对肺癌患者的癌细胞进行全基因组分析， 并通过重甲基特异性甲基化实验分析， 发现大部分肺癌患者的肺癌组织SHOX2发生高度甲基化[6]， SHOX2基因的甲基化有可能成为肺癌的早期筛查指标。RASSF1是从最小纯合缺失区分离出的一种能与DNA修复蛋白XPA相互作用的基因， 其中一种RASSF1A已被确认为是一种候选肿瘤抑制基因， 在多种实体肿瘤中表达异常， 并参与肿瘤的发生、发展过程[7]， 在肺癌、肾癌等肿瘤中均发现。有研究利用基因组测序法检测RASSF1基因启动子CpG位点的甲基化状态， 发现40%的肺癌组织中标本中RASSF1As基因启动子CpG位点完全甲基化[4]。

目前， 电子纤维支气管镜已成为诊断呼吸道肿瘤的主要工具[8， 9]， 因而进行电子纤维支气管镜取样后的肺泡灌洗液进行基因的甲基化检测可减少患者的机体损伤， 也是实现肺癌早期诊断， 提高肺癌患者生存率的重要途径。本文检测肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化的情况， 肺泡灌洗液SHOX2基因甲基化诊断敏感性为87.88%， 特异性为89.35%， 诊断准确率为89.11%。肺泡灌洗液RASSF1A基因甲基化诊断敏感性为81.82%， 特异性为93.49%， 诊断准确率为91.58%。可见SHOX2和RASSF1A基因甲基化检测对临床肺癌均具有诊断价值， 符合相关研究结论 [10， 11]。本研究中， 肺泡灌洗液SHOX2联合RASSF1A基因甲基化诊断Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肺癌的敏感性分别为75.00%（6/8）、94.12%（16/17）、83.33%（5/6）、100.00%（2/2）， 因为肿瘤细胞特异性形态变化未明显显示及病理取样局限性等原因， 早期检测肺癌的检出率受限[12]， 而其客观性也受病理诊断医生的主观意识影响极大， 导致肺癌早期发现早期治疗的临床目标难以实现。据相关其他研究提示， 部分甲基化阳性的肺部结节患者即使现阶段病理和影像学不支持肺癌的诊断， 随访6个月后， 有部分患者会呈现肺癌的临床指征[13]。

本研究结果可见， SHOX2基因甲基化能较好的区分肺部良恶性病变， 显示甲基化的SHOX2不仅可以作为早期检测的生物指标， 而且SHOX2甲基化可以作为非小细胞肺癌预后的独立预测指标， 这与目前研究结论相符合[14]。RASSFlA基因调控的靶基因涉及基因转录、细胞周期、细胞凋亡等多方面功能， 是一种新发现的肿瘤抑制基因， 在肿瘤发生及发展过程中的作用尤为重要。目前认为， RASSFlA基因表达失活主要与启动子区异常的高甲基化、杂合性缺失及染色体缺失有关， 是一种较早发现的与肺癌相关的抑癌基因， 能有效提高腺癌检出， 所以与SHOX2联合， 能较好提高早期肺癌检出率， 鉴别肺小结节的良恶性临床诊断[15]。结合病理细胞学检查结果显示， 各肺癌病理类型样本均有较好的检出效果， 鳞癌和小细胞肺癌效果更好， 估计是由于小细胞和鳞癌发生部位居中， 纤维支气管镜易于到达， 取得脱落细胞数量比周边组织位置高， 甲基化检测结果容易被显示出来。

异常甲基化是很多肿瘤的里程碑事件， 甲基化修饰在肿瘤形成的早期即发生， 同时DNA甲基化的检测， 在实验室容易实现开展检测， 不容易被取样部位、细胞形态学改变、人员技术水平等因素限制。同时肺泡灌洗液的获取对患者造成的机体损伤较少， 在临床易于开展。

总之， 肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化的检测， 能提高早期肺癌检出率、弥补细胞學的敏感性和客观性不足的缺憾， 有助于对早期肺癌的诊断， 是肺癌早期诊断重要的分子标志物。

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[收稿日期：2019-04-11]