基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程

郑庆霞，刘萍萍，陈 霞，王 冰，翟 妞，陈千思，金立锋，路 鑫，徐国云，张 慧，许国旺，周会娜*

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

2.中国科学院大连化学物理研究所，辽宁省大连市中山路457号 116023

烟叶化学成分与感官品质［1-6］、燃烧特性［7］等紧密相关，其直接或间接来自鲜烟叶中积累的代谢物质，如鲜烟叶中的质体色素［8-9］、多酚类物质［10-11］、游离氨基酸［12-16］等与烤后烟叶的外观质量、评吸质量以及致香成分质量分数等紧密相关。尽管通过农艺栽培措施、常规育种、基因调控等手段影响鲜烟叶中的代谢物质从而实现对烟叶品质的调控一直是烟草农业的研究热点，但进展较为缓慢，其原因可能在于烤后烟叶化学成分的形成是鲜烟叶全部代谢物质经过调制后的综合表现，而目前研究的侧重点则局限于较少的一部分代谢物，且缺乏对这些代谢物在烤后烟叶化学形成过程中的作用与贡献的综合评价与系统认识。因此为了进一步扩展对鲜烟叶代谢物的认识，衡量鲜烟叶代谢物质对烤后烟叶化学成分、感官品质等形成的影响，有必要在组学水平上开展鲜烟叶的代谢物质研究。

作为组学技术之一，代谢组学技术可对生物体、组织、细胞等体系内的小分子物质（小于1 500 Da）进行较为系统和全面的分析。当前，代谢组学技术在农作物育种［17-19］、转基因效应评价［20-21］、生物胁迫与非生物胁迫［22-23］等研究中的应用日趋广泛［24］。烟草代谢组学技术平台在中国烟草基因组重大专项第一个五年计划期间就已经建成并运行，而随着第二个五年计划的实施及功能基因研究的全面展开，代谢组技术在评价鲜烟叶内在变化、快速筛选编辑烟株及评估分析基因功能等方面的应用需求迫在眉睫；同时随着多家单位合作的深入，也对不同单位产生数据的一致性和可比性提出了更高的要求。因此有必要对烟草代谢组学研究从样品采集到数据分析建立统一的操作流程，以便于进一步普及烟草代谢组学研究技术，加快烟草基因研究和精准育种进程。

在代谢组学研究中，往往采用多种检测方法以期尽可能地弥补单一检测技术对代谢物检测的局限性和偏向性［25］，目前较多采用的代谢组检测技术有 NMR［26］、GC-MS［27］和 LC-MS［28］等。在医学代谢组学中已经有比较全面的代谢组学检测方法［29-30］可以参照，在植物代谢组学领域尤其是烟草代谢组学研究方面尚没有一个统一可供参考的代谢组学检测流程。因此，基于烟草代谢组学的特殊性及仪器的普及性和可操作性，本研究中建立了基于GC-MS和LC-MS技术的烟草鲜烟叶代谢组学检测分析流程，方法涵盖烟叶中常见的初生及次生代谢产物500余种，旨在促进烟草代谢组学的推广及应用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

2014年分别在云南祥云、贵州遵义和河南襄县三地同时种植红花大金元、中烟100和K326，采集其旺长期、现蕾期、盛花期、下部叶成熟期、中部叶成熟期前、中部叶成熟期6个生育期第十叶位烟叶后，迅速用带有编号的锡箔纸包裹后在液氮中速冻，10 min后转移并包埋于装有足量干冰的加厚泡沫箱中，快速运至实验室。在实验室中开箱检查后，将尚有充足干冰余存且冷冻状态保持较好的样品于-80℃超低温冰箱中保存。

甲酸、乙腈、无水乙醇、正己烷、氯仿、甲醇、异丙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸（色谱纯，美国Merck、Fisher、J T Baker公司）；丙酮、甲酸铵、氢氧化钾、氢氧化钠、氯化钠、三乙胺（AR，上海麦克林生物科技有限公司）。衍生化试剂MSTFA［N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺］和BSTFA［N,O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺］（＞99.0%，美国Sigma Aldrich公司）。各标准品分别购自美国Sigma-Aldrich、Chromadex、Acros Organics公司和加拿大TRC公司等。

BSA2245-CW型电子分析天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius公司）；K20Nx型恒温培养振荡器（杭州博日科技有限公司）；5424型台式高速离心机（德国Eppendorf公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；KQ-700DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；25EL型真空冷冻干燥机（美国Virtis公司）；N-EVAPTM112型氮吹仪（美国Organomation公司）；MJ-35BE01A型搅拌机（美的集团有限公司）；1260型高效液相色谱仪、7890/5975型气质联用仪、1290/6540型液相色谱-飞行时间质谱联用仪（美国Agilent公司）；Thermo TRACE 1300/TSQ8000型气相色谱-三重四极杆质谱联用仪、SPD111V型真空浓缩仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Acquity UPLC-SQD型液相色谱-单四极杆质谱联用仪（美国Waters公司）。

1.2 方法

1.2.1 烟叶样品处理

从超低温冰箱中取出烟叶冷冻样品，在液氮冷却下初步粉碎、混匀，分为两部分：一部分作为冷冻鲜烟叶样品继续于-80℃保存，使用前于研钵中在液氮冷却下研磨成粉末；另一部分烟叶样品经真空冷冻干燥后放入搅拌机中粉碎成粉末状，装入50 mL离心管中密封，于-80℃超低温冰箱中保存。

1.2.2 烟叶代谢组检测

为了尽可能多地检测出鲜烟叶中的代谢物，除了使用液相色谱对植物色素进行检测外，文献及本研究中基于LC-MS和GC-MS技术建立了针对不同极性、不同物质种类的多种检测方法，如表1所示。其中靶向检测方法5项，非靶向检测方法3项，这些方法中，方法2（多酚/类黄酮检测）、方法3（脂类检测）、方法6（萜类检测）、方法8（非靶向GC-MS检测）相关文献［31-34］中已有详细描述，以下主要对其他4种方法进行描述。

1.2.2.1 烟叶样品中的色素测定

冷冻鲜烟叶样品和冻干鲜烟叶样品色素的质量分数按照 YC/T 382—2010［31］的方法测定。

1.2.2.2 基于LC-MS平台的烟叶代谢组检测

方法1-游离氨基酸：准确称取冻干烟叶粉末35 mg于2 mL离心管中，加入2 mL提取液（70%的乙醇，含内标正缬氨酸，浓度为5 mg/L）；置于摇床中，160 r/min、25 ℃，提取1 h，提取液3 000 r/min离心15 min后，再用0.22 μm水相滤膜过滤；采用Waters AccQ-Tag derivation kit试剂盒进行衍生，之后按照李好丽等［36］的方法进行色谱-质谱分析。

表1 基于LC-MS和GC-MS技术的烟草代谢组学检测方法Tab.1 Analysis methods for tobacco metabolomics based on LC-MS and GC-MS

方法4-基于LC-MS平台的非靶向分析：准确称取20 mg冻干烟叶粉末于2 mL离心管中，加入1.5 mL提取液（75%的甲醇，含内标伞形花内酯，浓度为2.5 mg/L），室温超声提取60 min，提取液12 000 r/min离心15 min；取上清液1 mL转移到2 mL样品瓶中，进行色谱-质谱分析。分析条件：

色谱柱：Agilent-Zorbax SB C18柱（2.1 mm×100 mm，填充物粒径1.8 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）；线性洗脱程序：2 min内流动相B的体积分数从15%上升至30%，2～10 min从 30%上升至 85%，10～15 min从85%上升至90%，17 min后上升至100%并保持3 min，然后回到初始比例，平衡4 min；流速：0.3 mL/min；柱温：60℃；检测波长：200～400 nm。检测模式：正离子模式；干燥气温度：350℃；干燥气流速：12 L/min；喷雾器压力：275.6 kPa；鞘气温度：350℃；鞘气流速：10 L/min；毛细管电压：3 500 V；喷嘴电压：480 V；锥孔电压：65 V；碎裂电压：130 V；八极杆射频电压：750 V；质量范围（m/z）：50～1 000 Da。

1.2.2.3基于GC-MS平台的烟叶代谢组检测

方法5-生物碱：准确称取150 mg冻干烟叶粉末于15 mL螺口耐压试管中，加入1.75 mL 5%氢氧化钠溶液，湿润样品，静置15 min；加入10 mL 0.01%的三乙胺/甲基叔丁基醚溶液，加盖密封后在室温下超声萃取15 min，然后6 000 r/min离心5 min。取2 mL有机相，GC-MS法分析烟碱质量分数；准确移取5 mL有机相，浓缩至0.5 mL，GCMS法分析其他低质量分数生物碱。烟碱和其他低质量分数生物碱的检测分两次进样完成，采用保留时间和选择离子（SIM）模式定性，双内标定量。分析条件：

色谱柱：DB-35MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.)；程序升温：（10 min）；载气：氦气；柱流速：1.0 mL/min；进样口温度：250℃；烟碱检测进样量：1µL，分流进样，分流比40∶1；其他生物碱检测进样量：2µL，分流进样，分流比10∶1。溶剂延迟：8 min；电离电压：70 eV；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；扫描方式：选择离子监测模式（SIM），生物碱的选择离子见表2。

表2 GC-MS检测生物碱的保留时间及定性、定量离子Tab.2 Retention times and single ion monitoring(SIM)parameters of alkaloid determination by GC-MS

方法7-有机酸：准确称取20 mg冻干鲜烟叶粉末于2 mL离心管中，加入提取液［二氯甲烷∶乙腈=1∶2（体积比），含内标（E）-2-己烯酸，浓度为0.303 μg/L］1 mL；超声萃取 60 min，静置；取 500µL上清液，用氮气吹干后，加入BSTFA 100µL，60℃衍生40 min，进行GC-MS分析。分析条件：

色谱柱：DB-5MS毛细管柱（50 m×0.25 mm i.d.× 0.25 μm d.f.）；程 序 升 温 ：80 ℃（0 min）min）；载气：氦气；柱流速：1.0 mL/min；进样量：1 µL，分流进样，分流比20∶1。溶剂延迟：7 min；电离方式：EI；电离电压：70 eV；离子源温度：250℃；传输线温度：280℃；扫描方式：选择离子监测模式（SIM），选择离子见表3。

1.3 数据处理

靶向分析方法：氨基酸分析方法应用Empower软件进行数据处理；其他靶标方法应用MassHunter软件进行处理。经软件处理提取定性和定量离子峰，内标归一化后，根据标准曲线的线性拟合方程对目标代谢物进行定量。

LC-Q/TOF非靶向分析方法：应用MATLAB高分辨质谱数据分析工具包，对采集的数据进行色谱信号基线校正、峰提取与注释、峰对齐等步骤后最终获得样品代谢物的保留时间和精确分子量列表，导入个人化合物数据库与谱库（Personal compound database and library，PCDL）进行搜库定性分析，采用内标归一化法对代谢物进行相对定量。

1.4 统计分析

将不同方法采集的代谢物的定性和定量数据汇总到一起作为代谢组的初始数据，采用ANOVA方差分析筛选差异代谢物，主成分分析使用Simca-14软件进行，对初始数据采用Z-score方法进行标准化。

2 结果与分析

2.1 鲜烟叶冷冻样品与冻干样品色素质量分数的比较

鲜烟叶样品冻干前后进行称量，得到失水率，按照失水率计算冷冻鲜烟叶样品的取样量，使冷冻鲜烟叶样品和冻干鲜烟叶样品的干物质质量相同，冷冻鲜烟叶和冻干鲜烟叶各称取6份，按照YC/T 382—2010［31］的方法测定烟叶色素的质量分数，如表4所示。除紫黄质外，各色素质量分数在冷冻鲜烟叶和冻干鲜烟叶之间差异不显著，表明冷冻干燥对烟叶色素的影响较小；紫黄质在鲜烟叶中的质量分数较低，在冻干鲜烟叶中没有检测到，可能是由于在冻干过程中存在一定的降解，使紫黄质的量降低到检测限以下；称取的6份冷冻鲜烟叶色素质量分数的变异较大，除紫黄质外，RSD均在20%以上，新黄质的RSD更是超过30%，这可能是由于冷冻烟叶易融化，称取时不易操作，难以准确称取；相比而言，冻干鲜烟叶的RSD值则均较低，最高的新黄质为10.8%，其他均在4%以下。色素质量分数的测定结果表明，鲜烟叶冷冻干燥对代谢物质量分数的影响较小，具有较低的RSD值，可以大幅提高测定结果的重复性和可靠性，同时冻干鲜烟叶可以在室温下操作，有利于准确称取，尤其适宜于大批量鲜烟叶样本的操作。因此鲜烟叶代谢组学分析采用冻干烟叶进行。

表4 冷冻鲜烟叶与冻干鲜烟叶色素的质量分数（n=6）Tab.4 Phytochrome contents in frozen and freeze-dried fresh tobacco leaves（n=6） ［μg·(g·DW)-1］

2.2 方法学表征

2.2.1 线性关系、检出限及定量限

按照1.2节方法分别配制靶向检测方法中所含标准品的系列浓度溶液，内标法进行线性回归分析。各靶向方法中目标物的线性回归方法及相关系数见表5～表7。可见，在一定浓度范围内，各标准品的质量浓度与相对峰面积具有良好的线性相关性，R2均大于0.99。采用稀释混合标准溶液的方法，分别以3倍和10倍信噪比确定检出限和定量限。

表5 游离氨基酸的标准曲线、相关系数、线性范围及检出限（LOD）、定量限（LOQ）Tab.5 Standard curves,correlation coefficients,linear ranges,limits of detection,limits of quantitation of free amino acids

表5（续）

表6 生物碱类化合物的标准曲线、相关系数、线性范围及检出限（LOD）、定量限（LOQ）Tab.6 Standard curves,correlation coefficients,linear ranges,limits of detection,limits of quantitation of alkaloid compounds

表7 有机酸类化合物的标准曲线、相关系数、线性范围及检出限（LOD）、定量限（LOQ）Tab.7 Standard curves,correlation coefficients,linear ranges,limits of detection,limits of quantitation of organic acids

2.2.2 方法重复性、仪器精密度及回收率

准确称取6份新鲜烟叶样品粉末进行平行处理，测定4个靶向方法的重复性。选择其中1份样品连续进样8次，检测仪器的日内精密度；将该样品每天连续进样8次并重复4 d，检测仪器的日间精密度；用新鲜烟叶样品粉末作为基质，选取高、中、低3个浓度水平进行4个靶向方法的加标回收率实验，每个浓度水平分别重复3次，结果取平均值，然后计算每个方法的回收率。实验结果见表8～表11。

表8 烟叶游离氨基酸测定方法的重复性、日内和日间精密度、平均回收率Tab.8 Repeatabilities,intra-day precisions,inter-day precisions and recoveries of determination methods for free amino acids in tobacco leaves

表8（续）

表9 烟叶生物碱测定方法的重复性、日内和日间精密度、平均回收率Tab.9 Repeatabilities,intra-day precisions,inter-day precisions and recoveries of determination methods for alkaloids in tobacco leaves

表10 烟叶有机酸测定方法的重复性、日内和日间精密度、平均回收率Tab.10 Repeatabilities,intra-day precisions,inter-day precisions and recoveries of determination methods for organic acids in tobacco leaves

表10（续）

表11 非靶向LC-MS测定方法的重复性和日内、日间精密度Tab.11 Repeatabilities,intra-day precisions and inter-day precisions of untarged LC-MS method

2.3 气质和液质联用技术在鲜烟叶代谢组学研究中的应用

2.3.1 代谢组数据采集结果

利用所建立的基于GC-MS和LC-MS技术的烟草代谢组学检测方法，共获得定性定量代谢物522个。如表12所示，涉及糖代谢、氨基酸代谢、三羧酸循环、脂质代谢等初生代谢途径，以及苯丙烷代谢、类黄酮代谢、异戊二烯代谢、生物碱代谢等次生代谢途径，其中通过标准曲线进行绝对定量的代谢物有101个，其他均为相对定量。

2.3.2 不同产区不同时期第十叶位烟叶代谢组表型分析

为了分析第十叶位叶片随生长发育其代谢组的变化情况，将获取的第十叶位鲜烟叶代谢组数据汇总到一起，由于不同代谢物之间质量分数的差异较大、定量方式不同等原因，在进行多元变量统计分析之前，将数据作标准化（Z-score）处理。主成分分析（PCA）结果表明，不同时期、不同产区烟叶的代谢组有按照产区聚集的特征。如图1所示，河南襄县种植的3个品种与贵州遵义和云南祥云产区的代谢组差异明显，遵义种植的3个品种则与清香型产区云南的3个品种在代谢组上较为接近。从各个产区的品种差异来看，河南襄县种植的3个品种在代谢组上的差异最为明显，尤其是在下部叶成熟期之前的各时期，3个品种的代谢组差异较大；云南种植的3个品种下部叶成熟期之后差异较大；贵州种植的3个品种中红大与K326的代谢组较为接近，而与中烟100的代谢组在整个生育期的差异均较明显；从生长发育时期来看，在主成分图上，各个产区不同品种随生长发育的变化情况较为一致；河南产区从时期3（盛花期）至时期4（下部叶成熟期）的代谢组变化最大，这一时期对应于打顶这一农艺措施；相比而言打顶对贵州和云南产区烟叶代谢组的影响较小，两个产区烟叶代谢组主要在下部叶成熟期后，不同时期之间的差异更大，而河南烟叶在这一时期后代谢组的变化相对较小。以上分析表明，不同品种种植在同一产区表现出相似的生长发育特征，而同一品种种植在不同产区其生长发育特征差异较大，即产区的生态特征对烟草生长发育的影响大于品种。

表12 鲜烟叶代谢组数据采集结果Tab.12 Identified metabolites from fresh tobacco leaves by metabolomics analysis

图1 3个产区第十叶位6个关键生育期的代谢轨迹Fig.1 Metabolic trajectory of PCA score plot for the tenth leaves at six key growth stages from three areas

2.3.3 胺类代谢物随烟叶生长发育的累积规律分析

对第十叶位鲜烟叶代谢组的进一步分析表明，绝大部分代谢物在不同生长发育时期的差异均达到显著水平（p＜0.05）。本研究中对差异显著的胺类（含游离氨基酸）代谢物进行了累积规律分析，发现绝大部分胺类物质包括游离氨基酸的积累均较有规律，其中大部分（30种）的质量分数均表现出随生长发育逐渐降低的变化趋势。总体上看，这些胺类代谢物在成熟期烟叶中的质量分数一般比旺长期、现蕾期等生长前期（1～3）低，仅有丙酰胺丙氨酸和多巴胺随生长发育其质量分数增加，其余氨基酸在3个产区、3个品种烟叶中的积累规律不一致，主要受产区的影响，即在同一产区的烟叶中积累规律较为一致，如色胺，其质量分数在河南襄县烟叶中表现出明显的随生长发育增加的趋势，而在云南祥云烟叶中的趋势则相反（图2）。

图2 胺类化合物质量分数随烟草生长发育的变化趋势Fig.2 Variations of amine compound contents in tobacco leaves at different growth stages

3 结论与讨论

采用田间液氮速冻、干冰包埋运输、超低温保存、冷冻干燥等方法获取适用于鲜烟叶代谢组分析的样品；建立了基于GC-MS和LC-MS技术的鲜烟叶代谢组分析方法，涵盖多种烟草初生和次生代谢产物；通过对质谱数据的归一化处理进行绝对定量和相对定量，获得代谢物质量分数信息；通过对多种方法代谢组数据的标准化进行多变量统计分析，结合其他统计分析方法来筛选、分析关键代谢物，确定了基于GC-MS和LC-MS技术的鲜烟叶代谢组分析流程，见图3。

图3 基于气质和液质联用技术的鲜烟叶代谢组分析流程Fig.3 Workflow of metabolomics analysis of fresh tobacco leaves based on GC-MS and LC-MS

对2014年采集的不同产区、不同生育时期的第十叶位鲜烟叶进行了代谢组分析，定性鲜烟叶中522种代谢物。主成分分析结果表明：不同生长发育时期的烟叶代谢组差异较大，随叶片生长衰老，不同代谢物表现出不同的积累规律，多数胺类物质（包括游离氨基酸）随生长发育其质量分数逐渐降低；不同产区、不同品种烟叶具有按照产区进行聚集的特点，即生态因素对烟叶代谢组的影响要大于品种因素。这也与烤后烟叶分析的结果一致，如对清香型风格不同产区烤烟的研究表明生态对烟叶的香味风格和化学成分的影响最大［37］。