基于ITS 2序列的15种淫羊藿属药用植物分类鉴定研究

(贵州中医药大学药学院， 贵阳 550025)

淫羊藿属(EpimdiumL.)作为小檗科(Beiberdaceae)的一种多年生草本植物，有较高的药用价值、观赏价值及分类学研究意义[1]，其药用最早记载于《神农本草经》。《中华人民共和国药典》1963版以来均有收载，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效[2]。现代研究表明，淫羊藿属含有黄酮类、酚苷类、多糖、色酮类等、淫羊藿次苷类、木脂素类、有机酸类、生物碱等各类化学成分约150个[4]，具有骨骼重塑、抗癌、抗衰老等功效[5]。不同种类、来源的淫羊藿药材品质差异大，研究淫羊藿属内的种间关系、进行分类鉴定及属内种的“真实身份”，国内外研究者做出了不懈努力[3]。但由于淫羊藿属因其独特的地理分布、杂交可育、种内变异等特点，其种间界定仍模糊不清，被认为是分类和系统发育上最具挑战和困难的类群之一[6-14]。

ITS 2是核基因上位于5.85 rRNA基因区和大的亚单位编码区之间的一个片段，其具有通用性好，变异性高，扩增和测序料率高等优点。在重楼属、葫声科、裸子植物、藻类、真菌和高等植物等药用生物的鉴定中扩增率和测序率均表现优越，种水平和属水平的鉴定成功率高，是鉴定物种属及物种水平的研究热点[15-17]。因此，进一步应用ITS 2序列，对淫羊藿属进行分类鉴定分析，为搞清淫羊藿属内种的“真实身份”提供参考，为该属植物的种质资源的保护与可持续开发利用奠定基础。

1 材 料

本次研究共收集了淫羊藿属15个种，共计46份实验材料。实验材料均采自原产地，由贵阳中医学院药学院何顺志教授鉴定，活体材料保存于贵州同济堂制药有限公司淫羊藿资源圃(见表1)。并从NCBI数据库中下载了淫羊藿属ITS 2序列27条(详见表2)。

2 方 法

2.1 淫羊藿植物总DNA提取与扩增

取硅胶干燥淫羊藿植物叶片约40 mg，根据试剂盒(Tiangen Biotech Co．，China)说明书操作步骤提取样品总DNA样本。本实验用于扩增的引物(ITS 2)由大连宝生物科技公司设计合成(ITS 2 F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，ITS 3 R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’)。总DNA均采用50μL扩增体系，引物正反序列各2μL、样品总DNA 2μL、2×Taq PCR MasterMix 24μL、加ddH2O补足50μL。反应体系为：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s；72 ℃，10 min；10 ℃-over，40个循环。扩增获得单一明亮条带的PCR产物样品委托上海生工进行双向测序。

表1 供试材料来源

种名编号产地种名编号产地1.柔毛淫羊藿RM_11.四川眉州2.箭叶淫羊藿JY_11.安徽黄山(E. pubescens)RM_22.四川都江堰(E. sagittatum)JY_22.湖南吉首RM_33.四川成都JY_33.浙江龙泉RM_44.四川隆昌JY_44.贵州凯里RM_55.四川北川JY_55.贵州修文3.巫山淫羊藿WS_11.四川巴中4.粗毛淫羊藿CM_11.贵州开阳(E. wushanense)WS_22.贵州雷山(E. acuminatum)CM_22贵州雷山WS_33.贵州修文CM_33.重庆武隆WS_44.湖北巴东CM_44.贵州龙里WS_55.重庆巫溪——5.偏斜淫羊藿PX_11.湖南张家界6.单叶淫羊藿DY_11.贵州绥阳(E. truncatum)PX_22.湖南芷江(E. simplicifolium)DY_22.贵州凤岗7.川鄂淫羊藿CE_11.重庆巫溪8.竹山淫羊藿ZS0011.湖北竹山(E. fargesii)CE_22.重庆巫山(E. zhushanense)ZS0022.湖北建始9.薄叶淫羊藿BY_11.四川茂县10.保靖淫羊藿BJ_11.贵州万山(E. membranaceum)BY_22.贵州贵阳(E. baojingense)BJ_22.湖南永顺BY_33.贵州安顺BJ_33.湖南城步11.湖南淫羊藿HN_11.广西资源12.天平山淫羊藿TPS011.贵州台江(E. hunanense)HN_22.湖南新宁(E. myrianthum)TPS022.贵州天柱HN_33.湖北鹤峰TPS033.贵州剑河13.淫羊藿YY_11.山西陵川14. 拟巫山淫羊藿BL_11.贵州雷山(E. revicornu)YY_22.山西陵川(E. pseudowushanense)BL_21.贵州雷山15.星花淫羊藿XH_11.湖北十堰BL_31.贵州雷山(E. stellulatum)XH_22.甘肃成县——

2.2 数据处理方法

测序所得峰图应用CodonCode Aligner V 2.06(CodonCode Co.，USA)软件进行校对拼接，去除引物区和低质量序列。所得各序列经ClustalXV 2.0 (Higgins D.G)软件进行多序列比对并查错，再应用The ITS 2 Database在线工具(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)进行注释剪切，去除序列两端质量较差的碱基，剪切得到的序列在NCBI

表4 基于ITS 2序列变异的15种淫羊藿属植物K 2 P遗传距离中进行BLAST，提取同源性较高的ITS 2序列。应用Geneious 10.0软件分析ITS 2的组成和结构特点，应用The ITS 2 Database中Predict功能进行ITS 2序列二级结构预测。使用MEGA 7.0软件计算(Kimura-2-parameter，K 2 P)距离值，比较ITS 2序列的种间、种内变异值；最后采用相似性搜索算法(BLAST 1)和最近距离法(Nearest Distance)考察ITS 2序列的鉴定成功率，应用最大似然法(ML)构建系统发育树。

编号BJBLBYCECMDYHNJYPXRMTPSWSXHYYZSBJBL0.0084BY0.01260.0042CE0.00420.00420.0083CM0.01260.00420.00830.0084DY0.00840.00000.00420.00420.0042HN0.00840.00000.00420.00420.00420.0000JY0.00840.00210.00420.00420.00420.00000.0000PX0.00000.00840.01260.00420.01260.00840.00840.0111RM0.00840.00000.00420.00420.00420.00000.00000～0.00420.0084TPS0.00840.00000.00420.00420.00420.00000.00000～0.00420.00840.0000WS0.00840.00000.00840.00420.00840.00000.00420.00840.00420～0.00410～0.00830.0042XH0.01260.00420.00830.00840.00840.00420.00420.0042～0.00840.01260.00420.00420.0063YY0.00840.00000.00420.00420.00420.00000.00000～0.00420.00840.00000.00000.00830.0042ZS0.00420.00420.00830.00000.00840.00420.00420.0042～0.00840.00420.00420.00420.00420.00840.0042DV2.61822.47442.49942.47442.61822.47442.47442.47442.61822.47442.47442.47442.61822.47442.4744

注：编号与表2相对应。

表2 淫羊藿属植物ITS 2序列NCBI查询情况

序号中文名 学名 GB编号ZS竹山淫羊藿 E. zhushanenseJN010312PX偏斜淫羊藿 E. truncatumJN010310WS巫山淫羊藿E. wushanenseAY362421,JF421495,JN010311CM粗毛淫羊藿E. acuminatumAY362423,FJ980426,FJ980427,JN010262BJ保靖淫羊藿E. baojingenseJN010264YY淫羊藿E. brevicornu AY362429,JN010267,KC733405CE川鄂淫羊藿E. fargesiiJN010279BY薄叶淫羊藿E. membranaceumJN010289BL拟巫山淫羊藿E. pseudowushanenseJN010298TPS天平山淫羊藿E. myrianthumJN010291 HN湖南淫羊藿E. hunanenseJN010283RM柔毛淫羊藿E. pubescens AY362416,JN010299JY箭叶淫羊藿E. sagittatumAY362427,FJ980429,JN010304DY单叶淫羊藿E. simplicifoliumAY362420,JN010307,KC494651XH星花淫羊藿E. stellulatumJN010308 DV八角莲Dysosma versipellisKY701310.1

3 结果与分析

3.1 淫羊藿属ITS 2序列特征分析

所有样品扩增成功率与测序成功率均为100%，表明ITS 2序列在15种淫羊藿属植物中的通用性好。应用Geneious 10.0软件进行序列分析，15种淫羊藿属ITS 2长度均为247 bp，GC含量为55.1%。本实验获得46条ITS 2序列，从GeneBank中获得27条，共计73条ITS 2序列，共存在75个碱基变异位点，其中箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿、单叶淫羊藿变异位点数量较多，位居前三，其余种类仅有1～3个变异位点。

3.2 淫羊藿属ITS 2序列种内和种间变异分析

应用MEGA 7.0软件通过K 2 P模型，统计淫羊藿属种间和种内遗传分化情况，获得的ITS 2序列的种内变异，最大种内变异，种内变异平均值，种间变异，最小种间变异，种间变异平均值值详情见表4。由表4可见，ITS 2的在淫羊藿属中的种间变异较小，ITS 2序列鉴定成功率约为60%。采用比对法(Blast)分析，ITS 2鉴定效率为75%。除箭叶淫羊藿存在2个种内遗传变异(0.004 2)、巫山淫羊藿存在2个种内遗传变异(0.008 3)外，其余种类种内遗传距离均为0。总体看，淫羊藿属与外类群(鬼臼属)遗传距离较远，易于区分。但属内种间遗传距离与种内遗传距离存在交叉情况，较为复杂，难以在分开。15种淫羊藿属植物ITS 2序列居于K 2 P下的种内与种间变异计算情况详见表5。

表3 ITS 2序列的种内和种间遗传距离

遗传距离 ITS2Avg intra avg0.0050±0.0031Avg intra max0.0058±0.0039Avg intra between intra-species0.0056±0.0044Avg interby G 0.0066±0.0012Avg inter by G min0.0007±0.0011Avg between inter by Genus0.0067±0.0037

注：Bootstrap 1 000次重复，支持数值仅显示自展支持率≥50%。

图1 基于ITS 2构建的15种淫羊藿属药用植物ML系统进化树

3.3 淫羊藿属ITS 2序列系统进化树构建

本实验通过测序获得ITS 2序列46条，从GeneBank查询获得27条，以及外类群八角莲ITS 2序列，总共73条ITS 2序列，应用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)，自展支持率(bootstrap)1 000次重复检验进行ML系统进化树构建(见图2)。由ITS 2系统进化树可知：淫羊藿属与鬼臼属八角莲各为一支，易于分开。本次研究的样品中，除薄叶淫羊藿、竹山淫羊藿、巫山淫羊藿外，其余均种类均能较好的进行聚类；巫山淫羊藿WS 1、WS 2、WS 3 聚为一支，WS 4、WS 5聚为一支；竹山淫羊藿的2个样品相差甚远，不能聚集。NCBI下载的ITS 2序列除单叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、箭叶淫羊藿外，其余种类能较好的聚类。但本次测序获得的ITS 2序列除粗毛淫羊藿、保靖淫羊藿外其余均不能与NCBI下载到的序列进行聚类。

3.4 淫羊藿属ITS 2序列二级结构预测

淫羊藿属ITS 2二级结构由1个中心环和4个螺旋区构成，第1螺旋区有3个茎节环，第2螺旋区有4个茎节环，第3螺旋区有2个茎节环，第4螺旋区有3个茎节环。15个淫羊藿属植物二级结构构型极为相似，长度均较相同，仅在臂环大小、开口位置、大小上具有一定区别。因此，从二级结构上难以将淫羊藿属种间进行分类鉴别。15种淫羊藿属植物ITS 2序列二级结构详见图2。

4 讨 论

淫羊藿属药用植物种类繁多，分布广泛，种的分布区域性强，给其准确鉴定带来了较大难度。作为历版《中国药典》和各个地方中药材和民族药地方标准来源最多的药物种类之一，不同药材来源种类和产地的化学成分构成比例差异较大，使得该药材的质量难以控制，最终导致临床药效不稳定。DNA条形码是以染色体组为基础，利用相对较短的DNA片段，构建核苷酸序列数据库，对待测样品进行序列数据比对，实现生物身份识别的方法。采用这种快速、有效、准确的方法对我国淫羊藿属药用植物进行鉴定，可解决物种基原混乱等问题，为合理开发利用我国淫羊藿属药用植物资源提供理论依据。

本研究对淫羊藿属药用植物的15个种46份材料进行了ITS 2序列条形码进行研究，结果表明，ITS 2引物通用性好，扩增成功率和测序成功率均为100%；序列长度均为247 bp。通过K 2 P模型评估序列鉴定效率，ITS 2序列鉴定成功率仅为60%，采用比对法(Blast)分析，ITS 2的种间鉴定效率为75%。从Barcoding Gap图可知，ITS 2序列有利于对淫羊藿属部分物种鉴定。从ML树图中鉴别能力分析结果得出，ITS 2序列ML系统进化树具有较好的鉴别能力，但部分种内与种间变异复杂，存在鉴定错误现象，这可能是序列错误或者种类杂交所致。淫羊藿属各样本种内与种间遗传较为混乱，变异遗传距离复杂，但ITS 2二级结构形态亦极为相似。可见，该序列的在遗传中的变异度较小，较为保守，但种内变异方向较为复杂，用其将各种间进行区分有一定难度，不适合单独作为该属条形码使用。本研究丰富了淫羊藿属植物研究数据，为其资源开发利用及系统关系的研究提供一定参考。但本研究收集的种类不够全面，部分种类居群来源较少，对该属的分子鉴定还需从大样本、多序列组合，结合地理格局、细胞器基因组等进一步讨论其种内与种间关系、物种形成、谱系、演化等问题。

注：图中1，2，3，4分别表示二级结构的第一螺旋区，第二螺旋区，第三螺旋区和第四螺旋区。

图2 淫羊藿属15个种ITS 2序列二级结构(编号与表2相对应)