牛奶蛋白改性纤维免疫层析快速鉴定方法*

深圳市计量质量检测研究院，国家营养食品质量监督检验中心，广东 深圳 518102

牛奶蛋白改性纤维是一种有别于天然纤维和化学纤维的新型纤维。其以牛奶为原料，经脱水脱脂和分离提纯等工序，使酪蛋白形成线性结构，再与聚丙烯腈(PAN)进行交联形成纺丝原液，最后通过湿法纺丝工艺制备而得(图1)[1]。牛奶蛋白改性纤维含有17种氨基酸，其因具有良好的亲肤性而越来越多地应用于内衣、床上用品等与皮肤直接接触的纺织品生产中[2-3]。

图1 牛奶蛋白改性纤维成型工艺流程

然而，由于牛奶蛋白改性纤维的生产成本较高，市场上用大豆蛋白改性纤维等价格较低的产品进行鱼目混珠的现象屡见不鲜。其根本原因在于，缺少有效的牛奶蛋白改性纤维鉴定方法。目前的鉴别方法主要依据FZ/T 01057.2—2007《纺织纤维鉴别试验方法 第2部分：燃烧法》，通过燃烧法鉴别纤维种类。然而，由于牛奶蛋白改性纤维和大豆蛋白改性纤维的燃烧特征区别并不显著，极易导致误判。文献[4]通过NaOH溶解法和红外光谱对牛奶蛋白改性纤维和大豆蛋白改性纤维进行鉴定，但部分化学染料的存在会对结果造成明显干扰。正是由于目前的蛋白改性纤维鉴定方法尚不完善，才使得鱼目混珠者有了可乘之机，因此亟待建立准确可靠且易于推广的牛奶蛋白改性纤维鉴定方法。

免疫层析方法基于抗原抗体的高度特异性反应原理，具有快速、简单、成本低等优势，被广泛应用于肿瘤标志物、生物毒素、过敏药等物质的快速检测[5-8]。蛋白改性纤维由于通过共价键交联了特定的蛋白质，因此其氨基酸序列具有了标志性特征。然而，利用免疫层析方法鉴别蛋白纤维面临两大难题：一是纺织工业中的蛋白纤维已经改性且多数经染色修饰，因而和天然蛋白存在较大差异，故难以被现有的抗体所识别；二是免疫层析需要在中性水溶液中进行，而改性后的蛋白质的水溶性较差。本研究以牛奶蛋白改性纤维为例，通过筛选改性酪蛋白标志物并制备其单克隆抗体，将免疫层析技术应用于纺织用蛋白改性纤维的鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)、牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白、二硫代苏糖醇(DTT)、氯金酸、Proclin 300(由美国Sigma公司生产)；硝酸纤维膜(NC膜)、玻璃纤维、样品垫、结合垫、吸水纸及PVC底板(由美国Millipore公司生产)。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

XYZ3100型三维胶体金点膜仪(由美国Bio-Dot公司生产)；Milli-Q型水处理系统(由美国Millipore公司生产)；Triple TOF 6600型ESI(Electron Spray Ionization)/TOF(Time of Flight)质谱(由AB SCIEX公司生产)。

1.3 试验样品

牛奶蛋白改性纤维(氨基酸质量分数为25.00%)、分别混纺莫代尔和羊毛的牛奶蛋白改性纤维(由上海正家牛奶丝科技有限公司生产)；大豆蛋白/黏胶混纺纤维(由富丽达纤维有限公司生产)；大豆蛋白/PVA(Polyvinyl Alcohol)混纺纤维(由嘉利蛋白纤维有限公司生产)；其他用于评估特异性的纺织材料(由深圳市计量质量检测研究院样品室提供)。

1.4 方法

1.4.1 改性蛋白肽段质谱分析

在0.1 g牛奶蛋白改性纤维中加入10 mL的DTT质量分数为0.10%的7M尿素水溶液，于60 ℃恒温搅拌1 h。上清液用胰蛋白酶质量分数为0.05%的水溶液稀释1 000倍，并于37 ℃孵育2 h后用孔径为0.2 μm的滤膜过滤，然后进行ESI/TOF质谱分析。检测结果于NCBI(National Center of Biotechnology Information)数据库中搜库比对。

1.4.2 单克隆抗体制备

由北京华大蛋白有限公司合成肽段，氨基酸序列为YLGYLEQLLR-Cys。单克隆抗体制备参照文献[9]。采用辛酸硫酸铵纯化单克隆抗体[10]。

1.4.3 胶体金储备溶液制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金储备溶液[11]，方法如下：将1.0 g柠檬酸三钠快速加入100 mL加热煮沸的氯金酸质量分数为0.01%的溶液中并不断搅拌，当溶液变为紫红色时计时，继续加热回流10 min，当溶液冷却后于4 ℃保存。

1.4.4 单克隆抗体-胶体金偶联物的制备

取1 mL胶体金储备溶液，使用浓度为0.2 mol/L的碳酸钠溶液调节胶体金储备溶液的pH值至6.0，将单克隆抗体溶液逐滴加入磁力搅拌的胶体金储备溶液中，搅拌30 min(分别以0.1、 0.2、 0.5、 1.0和2.0 μg/mL为单克隆抗体的标记质量浓度)，然后缓慢加入1 mL质量分数为10.00%的BSA溶液，搅拌反应30 min，封闭胶体金表面位点，继续加入1 mL质量分数为1.00%的PEG 20000溶液，搅拌30 min后，以6 000 g离心力离心30 min，弃去上清液后加入0.12 mL金标抗体复溶液(配方为含质量分数为0.05%的PEG 20000、 1.00%的BSA、 2.00%的海藻糖、0.05%的吐温-20以及0.10%的Proclin 300的水溶液)反复吹打沉淀，重悬金标抗体。

1.4.5 纸条的组装

使用三维胶体金点膜仪，分别以质量浓度为0.3、 0.6和0.9 mg/mL的牛酪蛋白以及质量浓度为1.0 mg/mL的IgG在NC膜上划线，作为T线和C线。样品垫用处理液(配方为含质量分数为1.00%的BSA、 0.50%的吐温-20、 0.05%的Proclin 300的PBS缓冲液，且pH值为7.2的水溶液)浸泡过夜。结合垫用质量分数为0.10%的吐温-20浸泡过夜，60 ℃下干燥2 h，再将单克隆抗体-胶体金偶联物喷涂于结合垫。NC膜、样品垫、结合垫均于37 ℃真空干燥2 h后，之后和吸水纸一起按照图2所示的结构粘贴于PVC底板上。使用切条机将其裁剪成4 mm宽的窄条后装上卡壳，并加入干燥剂，封装于锡箔袋中密封备用。

1.4.6 检测步骤

牛奶蛋白改性纤维检测流程见图2。称取1.0 g纤维样品加入10 mL的7M尿素水溶液中，沸水处理10 min，上清液用去离子水稀释20倍后量取0.15 mL加至检测卡的样品孔，5 min后按图2所示步骤判断结果。

图2 牛奶蛋白改性纤维鉴定流程

1.4.7 牛奶蛋白改性纤维的染色

选用直接耐酸大红4BS(C.I. Direct Red 23)、弱酸艳红B(C.I. Acid Red)、阳离子红X-GRL(C.I. Basic Red 249)以及活性红X-3B(C.I. Reactive Red 194)染料，参照文献[12]对牛奶蛋白改性纤维进行染色。

1.4.8 免疫层析法评估

以氨基酸质量分数为25.00%的牛奶蛋白改性纤维为实物标样，掺入不同量的PAN制备氨基酸质量分数分别为0.30%、 1.00%、 3.00%、 10.00%和25.00%的样品。使用免疫层析方法进行检测，以评估方法的检出限。

为验证该检测方法的可行性，采用其对2种混纺牛奶蛋白改性纤维、3种其他蛋白改性纤维、3种天然蛋白纤维、4种纤维素纤维和6种合成纤维进行鉴定。同时，为评估化学染料是否会对该检测方法的结果造成干扰，从蛋白改性纤维常用的直接染料、弱酸性染料、阳离子染料和活性染料中各选取了一种代表性染料进行染色，之后采用免疫层析法进行检测。

稳定性是胶体金免疫层析试纸条能否推广应用的关键参数。对于定性试纸条来说，批内和批间结果应当一致。本研究使用相同批次和不同批次的试纸条分别对同一种牛奶蛋白改性纤维(阳性对照)和PAN纤维(阴性对照)的稳定性进行测定。

1.4.9 免疫层析法应用

本研究从网络上购买了8个标签中标注有牛奶蛋白改性纤维的纺织品，并采用本研究建立的方法进行检测，以对市售标示有牛奶蛋白改性纤维的产品进行鉴定。

2 结果与讨论

2.1 牛奶蛋白改性纤维的特征肽段

寻找牛奶蛋白改性纤维的特征肽段是建立免疫检测的重要基础。虽然目前关于乳蛋白的研究已较为透彻，特征肽段已可从NCBI数据库中查询到，但是对于改性蛋白纤维，由于其交联反应较为复杂且多个活性位点发生了共价结合，必须重新进行分析。本研究通过胰酶水解法，从牛奶蛋白改性纤维中得到了20个特征肽段(表1)，分别来源于αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白，但并未发现乳清蛋白，说明牛奶蛋白改性纤维主要由上述4种酪蛋白构成。

表1 牛奶蛋白改性纤维经胰酶水解法处理得到的特征肽段序列

2.2 肽段的选择

虽然2.1节得到了牛奶蛋白改性纤维的特征肽段，但是合成肽段在空间结构和免疫原性上都和实际的蛋白存在差异，鉴于对20个肽段逐一进行测试的工作量较大，本研究通过以下原则进行筛选：

(1) 选择宏量蛋白上的肽段，如此可获得较高的方法灵敏度。αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白分别占牛酪蛋白的质量比为40.00%～50.00%、 5.00%～10.00%、 25.00%～35.00%和8.00%～15.00%。因此优先选择来源于αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的肽段。

(2) 选择含有酪氨酸的肽段。由于酪氨酸的苯基具有较强的免疫原性且在酪蛋白中含量较大，因此更容易诱导试验动物产生特异性抗体[13]。

(3) 尽量避免含有赖氨酸、组氨酸和半胱氨酸的肽段。牛奶蛋白改性纤维在成衣制作中需通过活性染料染色，而这类染料往往会和蛋白上的活性氨基、羟基和巯基结合，因此含有这类基团的氨基酸，如赖氨酸、组氨酸和半胱氨酸，应尽量避免作为分析靶标。

基于上述策略，本文选用来自于αs1-酪蛋白的序列3作为目标半抗原，该肽段含有两个酪氨酸，不包含易与活性染料结合的基团，具有良好的免疫原性和染色惰性。

2.3 牛奶蛋白改性纤维鉴定方法的建立

金标抗体的制备是胶体金标记免疫检测方法的关键步骤。由于抗体过多会使检测灵敏度变差，而胶体金过多会使抗体失活，因此抗体和胶体金的比例必须经过优化。本研究在氯金酸质量分数为0.01%的胶体溶液中加入不同量的抗体。图3所示为标记抗体的质量浓度对抗体活性的影响，表明当抗体质量浓度为0.5 μg/mL时，条带最清晰且不弥散、背景最干净。

图3 标记抗体质量浓度对其活性的影响

在此条件下，本研究还对T线抗原浓度和结合垫的抗体喷涂量(金标抗体量)这两个竞争金标免疫层析的关键参数进行了考察。和竞争ELISA(Enzyme-Linked Immune-Sorbent Assay)一样，T线抗原作为竞争物，其浓度也会影响免疫层析效果。金标抗体量和T线抗原浓度过低均会导致获得的T线的清晰度不足，使得结果难以判定，试纸条不稳定且容易失效，因而无法进行商品化应用。金标抗体量和T线抗原质量浓度过高，虽能获得清晰的T线条带，但因抗原或抗体过量，需要更高浓度的待测药物参与竞争反应，这将影响检测方法的灵敏度。表2所示为不同抗原抗体量下的试纸条显色情况和灵敏度。其表明，在T线抗原质量浓度为0.6 μg/mL、金标抗体量为6 μL/cm时，检测灵敏度最高且条带最为清晰。

表2 不同抗原抗体量下的试纸条显色情况和灵敏度

2.4 检测方法评估

样品的前处理对于鉴定方法至关重要。牛奶蛋白改性纤维是一种经过高度化学交联的蛋白质，常用的免疫学提取剂如PBST、 Tris-HCL等，无法对其进行提取。碱性溶液虽然能将其溶解，但是强碱条件下不能直接进行免疫分析，待pH调节至中性后蛋白又会析出。笔者课题组[14-15]研究发现，高温的7M尿素对变性蛋白具有良好的提取效果，稍加稀释即可用于免疫分析。如图4所示，本研究所建立的牛奶蛋白改性纤维鉴定方法，在检测含有氨基酸质量分数为0.30%的牛奶蛋白改性纤维时，T线出现条带，结果判定为阴性，因此该方法的检出限为1.00%，相当于能检测出混纺质量分数为4.00%牛奶蛋白改性纤维的纱线。由于混纺纱线中牛奶蛋白改性纤维含量在4.00%以下时，其已失去了牛奶蛋白改性纤维的特性，因此本研究所建立的方法能够满足鉴定要求。

图4 牛奶蛋白改性纤维的检出限

免疫层析法对不同纤维的检测结果见表3。其表明，该检测方法能够准确地从众多纤维中鉴定出牛奶蛋白改性纤维，并且染色不会对鉴定结果造成影响。

表3 免疫层析法对不同纤维的检测结果

免疫层析法的稳定性测定结果显示，未出现假阳性或假阴性，故可认为其检测准确率为100%。

2.5 市售产品调查

市售标示有牛奶蛋白改性纤维产品的鉴定结果见表4。由表4可知，内衣3和拖把的鉴定结果与实际不一致，说明关于牛奶蛋白改性纤维的标签标注亟待规范。

表4 市售标示有牛奶蛋白改性纤维的产品鉴定结果

3 结语

本研究通过质谱分析从现有的蛋白数据库中比对出牛奶蛋白改性纤维中的特征肽段，并结合纺织品印染的实际情况，确定特征肽段半抗原。基于此半抗原，制备了抗牛奶蛋白改性纤维特征肽段的单克隆抗体，建立了牛奶蛋白改性纤维胶体金免疫层析鉴定方法。该方法具有简单(只需对样品加热和稀释)、快速(整个检测过程约15 min)、准确(未发现假阴性和假阳性)、成本低(无需昂贵的分析仪器)的优势，有形成商品化检测产品并广泛推广的潜力。更重要的是，该研究方法具有广泛适用性，可为其他蛋白类纤维的鉴定提供新的思路。