苏木精-伊红染色制作骨骼肌组织教学切片的方法优化

吴怡娴，董娟娟，玛依热·吐尔洪，李琴，许彭，李秀梅

（新疆医科大学基础医学院形态中心 ，新疆乌鲁木齐 830011）

骨骼肌组织形态观察是组织学实验教学中的一项重要内容。在骨骼肌的肌原纤维上明暗相间的横纹结构是本科教学大纲中必须要求掌握的内容，也是形态学科研和临床病理重要的观察内容。实验教学中骨骼肌通常采用常规的苏木精-伊红染色法（HE染色法）。在HE染色中，横纹结构在不同种属以及切片厚度之间是否有差异，目前报道不多。我们将人、兔、狗的骨骼肌结构在光学显微镜下做了比较，并对狗的骨骼肌组织在不同切片厚度的情况下横纹结构的差异进行筛选，为获得合格的骨骼肌组织教学切片提供指导。

材料与方法

1 材料和试剂

骨骼肌组织分别来源于人、兔子及狗的四肢，苏木素染液、伊红染液均购自珠海贝索生物技术有限公司。

2 石蜡切片制备

骨骼肌组织置于4%甲醛水溶液内固定，24h后更换新鲜固定液，继续固定1～2d后，将组织块置于自来水下冲洗，采用梯度乙醇溶液脱水、二甲苯透明、石蜡（60℃）浸润2h后包埋成蜡块。Leica RM2235切片机切片，切片厚度分为2µm、3µm、4µm、5µm、6µm， 45℃蒸馏水中展片、裱片，60℃烘片干燥。

3 染色及封片

二甲苯脱蜡，无水乙醇、95%、90%、80%、70%梯度乙醇脱二甲苯，苏木素染液染细胞核10min，蒸馏水水洗，1%盐酸酒精分色，自来水蓝化5min，光镜下检查细胞核分色质量，伊红染液染细胞质2～5min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明各、中性树胶封片。

结 果

1 不同种属之间骨骼肌横纹结构差异

高倍光镜观察显示，人的骨骼肌纤维较细，肌原纤维排列整齐，横纹结构明暗相间较细密（图1A）；兔的骨骼肌肌原纤维明显，但横纹结构仅在部分肌原纤维上隐约显示（图1B）；狗的骨骼肌肌原纤维平行整齐紧密排列，横纹结构明显，清晰可见（图1C）。

图1 人（A）、兔（B）和狗（C）骨骼肌HE染色。比例尺，20μmFig. 1 HE staining of the skeletal muscles of human (A), rabbit (B) and dog (C). Scale bar, 20μm

2 狗骨骼肌切片不同厚度对HE染色横纹结构显示的影响

在不同厚度的狗的正常骨骼肌组织切片中，骨骼肌肌原纤维及横纹结构存在差异：厚度2µm的切片中，骨骼肌肌原纤维及横纹结构几乎看不到，骨骼肌纤维呈现一片均质红染（图2A）；厚度3µm切片中骨骼肌肌原纤维呈现，但横纹结构显示不清晰（图2B）；厚度4µm（图2C）、5µm（图2D）切片中骨骼肌肌原纤维及横纹结构清晰可见；厚度6µm切片中骨骼肌切片横纹结构明显，但肌原纤维及细胞核重叠，不利于学生观察（图2E）

讨 论

组织学是研究机体正常微细结构及其相关功能的科学，观察组织切片是组织学的基本学习方法，合格的实验教学切片是组织学实验教学质量的重要保障，而实验教学切片，对染色的效果、切片存放时间等要求较高[1]。横纹肌包括骨骼肌和心肌，在制作骨骼肌实验教学切片的制作中常出现肌原纤维显示不清楚，横纹结构不典型的情况[2-4]。由于人的正常组织来源困难，且需在死亡后4～5h以内取新鲜组织，否则就会出现组织自溶，破坏细胞正常结构，而动物的某些组织结构与人体组织结构相近，且组织器官相对容易获得，故在日常实验教学中，往往用动物的器官组织来制作教学切片。我们比较了人、狗、兔子的骨骼肌组织结构，发现狗的骨骼肌组织学结构与人的骨骼肌结构相似，骨骼肌纤维成圆柱体，相比兔的骨骼肌结构，肌原纤维排列整齐，横纹结构更典型，故我们认为狗的骨骼肌组织可以替代人的骨骼肌用于实验教学中。为了进一步探讨骨骼肌形态结构与石蜡切片厚度之间的关系，我们将狗的骨骼肌组织制作成2µm、3µm、4µm、5µm、6µm的厚度分别进行比较，发现在HE染色中，厚度为4µm和5µm的狗骨骼肌组织，肌原纤维束排列整齐，横纹清晰，背景干净、颜色对比性高，厚度4µm和5µm的狗骨骼肌组织可较好的分辨和观察骨骼肌组织的形态结构。其他厚度的骨骼肌组织切片由于太薄或略厚，导致肌原纤维及横纹结构不清晰，甚至观察不到横纹结构。6µm厚度的骨骼肌组织切片细胞层次不清楚，堆叠严重，成像不清楚，难以看到完整细胞形态。本实验证明，狗的骨骼肌组织结构与人相似，可以用于教学切片制作，切片厚度以4～5µm为佳，在HE染色中可以清晰显示肌原纤维及横纹结构。优化骨骼肌组织取材、切片厚度等条件，可显著提高骨骼肌组织的制片效率与切片质量，为组织学实验教学提供保障。

图2 不同厚度狗骨骼肌切片中横纹结构的对比。A，2µm；B，3µm；C，4µm；D，5µm；E，6µm；比例尺，20μmFig. 2 Comparison of cross striation structures in skeletal muscle sections of dog with different thicknesses. A, 2µm; B, 3µm; C, 4µm; D, 5µm; E, 6µm;scale bar, 20μm