基于TCGA数据库分析CBX2在膀胱癌中的表达及其临床与流行病学意义

马鑫，温元毅，王勇，周艳华

(1资阳市第一人民医院，资阳 641300；2咸阳市第一人民医院，咸阳712000)

膀胱癌是泌尿生殖系统中比较常见的恶性肿瘤，50～70岁为膀胱癌的高发年龄，且发病率有明显的上升趋势[1,2]。也是治疗费用最多的恶性肿瘤之一。膀胱癌是世界范围内发病率和死亡率都比较高的肿瘤[3]。膀胱癌的发病的病因比较复杂，是内在的遗传因素和外在的环境因素共同作用的结果[4]。因此，对膀胱癌的发生发展过程及侵袭转移相关机制的深入研究，有助于我们加深对膀胱癌的认识，有助于我们的膀胱癌治疗、预后以及诊断水平的不断提升[2]。

CBX是多梳蛋白家族（polycomb group protein,PCG）的重要组成，PCG 蛋白的异常调节与多种肿瘤相关[5]。CBX2作为肿瘤预后标志物的报道逐渐的增多，在多种癌症中，CBX2高表达提示肿瘤的迁移增加和患者低存活率。越来越多的基础研究及临床证据表明CBX2的高表达促进肿瘤的发生、发展[6]。但是目前为止，对CBX2 的临床意义和生物学作用仍不清楚。

因此，我们选取CBX2基因作为本文的研究目标，通过肿瘤生物信息学数据库全面的分析CBX2基因与膀胱癌临床病理特征和预后的相关性，为膀胱癌的发生及发展的机制、诊断、预后提供了新的线索和思路。

材料与方法

1 利用GEPIA分析CBX2的基因表达水平

GEPIA是由北京大学研发的一种癌症表达谱数据的交互式web服务器，收录来自TCGA和GTEx的9736个肿瘤样本和8,587个正常样本的RNA测序表达数据，用于分析来自TCGA和GTEx项目的基因差异表达及其与预后的相关性。因此我们应用GEPIA数据库用箱线图来分析在膀胱癌组织和正常组织中的CBX2基因的转录水平。

2 应用UALCAN数据库分析CBX2的表达

UALCAN是一款操作简单、快速有效的TCGA数据挖掘分析的网站工具，可以直接查询多个基因在肿瘤里的表达和与预后的关系。UALCAN数据库有GEx pro file和Survival Pro file，分析的分别是基因的表达情况和基因表达与预后的关系，而后面的HPRD，Genecards等是相关的数据库。我们看到有各种类型的gene class，有的是蛋白类型，比如激酶kinase、泛素连接酶、蛋白酶、磷酸酶。也就是说，我们可以直接查看这一类基因在TCGA中的数据情况。

UALCAN 数据库可以直接查询多个基因在肿瘤里的表达和与预后的关系，我们应用UALCAN 数据库分析CBX2 在膀胱癌中各个临床病理参数的表达水平。

3 利用The Human Protein Atlas数据库分析CBX2的表达

人类蛋白质表达图谱（Human Protein Atlas）简称HPA数据库，包含全部24,000种人类蛋白质的组织和细胞分布信息。该数据库使用特制的抗体应用免疫组织化学技术，检测每一种蛋白质在48种人类正常组织、20种肿瘤组织、47个细胞系和12种血液细胞内的分布和表达情况，其结果提供至少576张免疫组织化学染色图，并由专业人员阅图和标引。这些受检的组织来自144个不同个体和216个肿瘤组织，以保证染色结果具有代表性。HPA数据库不仅用于组织和细胞系的免疫染色，也可分析正常组织和肿瘤组织蛋白差异表达。本研究选取HPA数据库中CBX2免疫组织化学抗体（HPA023083）对正常膀胱组织和膀胱癌组织进行的免疫组织化学实验，分析正常膀胱组织和膀胱癌组织中蛋白表达及抗体染色程度。

4 利用LinkedOmics分析CBX2的表达与膀胱癌临床病理和流行病学参数的相关性

LinkedOmic包含32种来自TCGA所有癌症类型的多组数据。这个网站有3个分析模块：Link-Finder，LinkInterpreter 和 LinkCompare。本研究应用LinkFinder模块分析CBX2的mRNA表达水平与膀胱癌的临床病理特征的关系。统计方法采用了非参数检验。

5 利用LinkedOmics分析膀胱癌的临床病理特征与患者生存率的关系

应用LinkedOmics网站分析膀胱癌患者临床病理特征与患者生存率的关系。统计方法采用了非参数检验。

6 应用SurvExpress数据库分析CBX2 的表达与膀胱癌患者生存率的关系

SurvExpress（http://bioinformatica.mty.itesm.mx-:8080/Biomatec/SurvivaX.jsp）是一种多功能的在线生物标记验证工具，使用生存分析评估基因表达在各种癌症中的重要性。

结 果

1 CBX2在膀胱癌中高表达

应用GEPIA检测CBX2 mRNA在正常膀胱组织（n=28）及膀胱癌（n=404）中的表达水平显示：与正常膀胱组织相比，CBX2在膀胱癌中表达明显升高（图1）。应用The Human Protein Atlas中CBX2抗体（HPA023083）进行免疫组织化学检测显示：膀胱癌组织中CBX2免疫反应性显著强于正常膀胱组织（图2）。

图1 GEPIA分析CBX2 mRNA在正常膀胱及膀胱癌组织中的表达。*，0.01＜P＜0.05Fig.1 GEPIA analysis for expression of CBX2 mRNA in normal bladder and bladder cancer tissue. *, 0.01＜P＜0.05

图2 CBX2蛋白在正常膀胱组织与膀胱癌组织的表达的免疫组织化学检测Fig. 2 Immunohistochemical examination for expression of CBX2 protein in normal bladder and bladder cancer tissue

2 CBX2 mRNA表达水平与膀胱癌不同临床病理参数的关系

应用UALCAN数据库对CBX2 mRNA表达水平与膀胱癌不同的临床病理参数的关系分析显示如下：①CBX2 mRNA在膀胱癌中的表达明显高于正常膀胱组织 (图3A)，Tumor vs Normal：P=6.7e-09。②在膀胱癌的分期中，CBX2 mRNA的表达在Stage 4表达最高（图3B），Stage 2、3、4与Normal比较，P值分别为1.62e-05、1.06e-07和1.34e-07。③分析与种族的关系显示，BX2 mRNA表达在African-American中显著高于其他种族，Caucasian vs Normal：P=3.85e-09; Afirican-American vs Normal：P=9.84e-04; Caucasian vs Asian，P=1.78e-05;A firican-American vs Asian,P=5.56e-03。④ 对与性别的关系分析显示（图3D），Male vs Normal,P=1.04e-08; Female vs Normal,P=4.95e-07；但男女患者之间无明显差异；⑤对与体重的关系分析显示，CBX2 mRNA表达在超重人群显著高于正常体重人群（图3E），Normal-weight vs Normal,P=4.34e-05;Extreme-weight vs Normal,P=8.51e-09; Obese vs Normal，P=5.80e-05; Normal-weight vs Extreme-weight,P=6.58e-03；⑥对与年龄的关系分析显示，61～80岁组CBX2 mRNA的表达显著高于其他年龄组（图3F）: 41～60YvsNormal,P=4.24e-05; 61～80YvsNormal,P=2.64e-09; 81～100YvsNormalP=7.16e-03;21～40Yvs41-60Y,P=1.35e-08; 21-40Y vs 61～80Y,P＜ 1e-12; 21～40Yvs81-100Y,P=6.35e-04。

图3 CBX2 mRNA表达水平与膀胱癌不同临床病理参数关系的UALCAN分析。A，标本类型；B，肿瘤分期；C，患者种族；D，患者性别；E，患者体重；F，患者年龄Fig. 3 UALCAN analysis for the correlation between CBX2 mRNA expression level and clinicopathological parameters of bladder cancer. A, sample types; B, tumor stage; C, patient’s races; D, patient’s gender; E, patient’s weight; F, patient’s age

3 应用LinkedOmics数据库分析CBX2 mRNA在膀胱癌临床不同病理参数相关性分析

应用LinkedOmics数据库分析CBX2 mRNA表达与膀胱癌不同临床病理参数的关系显示，CBX2 mRNA的表达与种族、病理分期N分期和是否接受放射治疗有关而与其他参数无关（图4）： African-American的 CBX2 mRNA表 达 最高（P=1.147e-03）；在膀胱癌患者病理分期N分期中，N1的 CBX2 mRNA表达水平高于其他组（P=1.453e-02）；放射治疗患者中CBX2 mRNA的表达较未进行放射治疗的患者表达较低。

图4 CBX2 mRNA表达水平与膀胱癌不同临床病理参数关系的LinkedOmics分析。A，患者人种,1.147e-03；B，放射治疗，1.403e-01；C，病理N分期,1.453e-02；D，病理分期，3.458e-01；E，种族，4.657e-01；F，T分期，5.132e-01Fig.4 LinkedOmics analysis for correlation between CBX2 mRNA expression level and clinicopathological parameters of bladder cancer. A, patient’s races，1.147e-03; B, radiation therapy，1.403e-01; C, pathologic N staging，1.453e-02; D, pathologic staging，3.458e-01; E，ethnicity，4.657e-01;F, pathologic T staging，5.132e-01

4 膀胱癌患者临床病理特征与生存率的关系

应用LinkedOmics数据库对膀胱癌患者膀胱癌临床病理特征与生存率相关性进行分析显示：膀胱癌的生存率与N分期（图5A，P=1.824e-03, n=361）、淋巴结数量（图5B,P=1.868e-05, n=292）、年龄（图5C,P=5.588e-05, n=401）和M分期（图5D,P=6.317e-03,n=199）有关，而与T分期 (图5E, 1.000e+00, n=370)和种族 (图5F, 1.079e-01, n=384)无关。

图5 膀胱癌患者临床病理特征与生存率关系的LinkedOmics分析。A，病理N分期,1.824e-03; B，转移淋巴结数量,1.868e-05；C，年龄,5.588e-05；D，病理M分期；6.317e-03; E，病理T分期,1.000e+00; F，种族；1.079e-01Fig.5 LinkedOmics analysis for the correlation between clinicopathological parameters and prognosis of bladder cancer patients. A, pathologic N staging, 1.824e-03; B, number of metastasis lymph nodes, 1.868e-05; C, age, 5.588e-05; D, pathologic M staging, 6.317e-03; E, pathologic T staging,1.000e+00; F, race, 1.079e-01

5 CBX2 mRNA是BLCA的独立预后因子

此外，为了进一步阐明 CBX2在BLCA中的作用，使用SurExpress数据库用COX回归分析分析了792例膀胱癌患者CBX2 mRNA表达水平与患者生存率的关系。 使用CBX2 mRNA表达水平作为二分法的风险因子计算预后指数。CBX2 mRNA在高风险BLCA患者中表达水平高，在低风险的BLCA中表达水平低，差异具有统计学意义（CI = 53.96，HR=1.9，logrankP=1.057e-05，图6B）。

图6 应用SurvExpress数据库分析CBX2 mRNA表达水平与膀胱癌患者生存率的关系。A，CBX2 mRNA表达水平与患者生存天数的关系，CI = 53.96，HR =1.9，logrank P = 1.057e-05；B，CBX2 mRNA表达水平与高危分组，P=6.91e-133Fig. 6 SurvExpress analysis for the correlation between the CBX2 mRNA expression level and the survival rate of bladder cancer patients. A, the correlation between CBX2 mRNA expression level and survival days of patients, CI = 53.96，HR =1.9，logrank P = 1.057e-05；B, the correlation between CBX2 mRNA expression level and high risk grouping, P=6.91e-133

讨 论

膀胱癌是泌尿系统发病率比较高的恶性肿瘤，因为其本身的特殊性早期不容易被诊断，一旦发现患者出现了明显症状前来就诊时，大多已经处于临床治疗困难、预后较差的阶段[7]。因此很多患者就需要频繁的随访以及必要的手术治疗，这些严重影响了患者的生活质量和增加了沉重的经济负担。对于早期能够发现的膀胱癌，其5年生存率高达 94%，所以在临床上膀胱癌最具价值的研究方向是膀胱癌的预测和诊断[8]。临床医务人员一直在关注膀胱癌的预测及复发监测进展，因此寻找新的膀胱癌新的特异性诊断标志物以及探索新的治疗靶点和预后生存指标尤其显得重要[4,9]。

膀胱癌最重要的临床特点就是术后极易出现肿瘤的复发，同时会有很大比例的患者出现肿瘤浸润肌层[10]。因此，对于膀胱癌的发生发展过程，侵袭以及转移的相关机制的研究有助于我们对膀胱癌的认识以及治疗至关重要[11]。CBX 蛋白家族包括5个成员，CBX2、CBX4、CBX6、CBX7 和 CBX8，大量的基础实验及临床证据提示CBX在肿瘤的发生、发展中起着比较关键的作用[12]。CBX2是定位于人染色体 17q25.3 上的一个蛋白编码基因[5]。有新的研究表明，在对人类造血干细胞进行研究的过程中发现CBX2 的敲低能够促进p21的表达，产生抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡作用[6]。我们查阅相关文献发现，CBX 家族的CBX8 可以同p53发挥协同作用[13]。有研究表明，沉默CBX2基因可以通过诱发caspase3 介导的细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的存活，于是提出了对CBX2抑制可以诱导肿瘤细胞的凋亡，这为其有可能成为新的肿瘤治疗靶点及预后诊断指标提供理论支持[14]。另外有研究显示，CBX2的活性与细胞周期依赖性调节相关，说明CBX2有可能参与了肿瘤细胞周期的有关调控[15]。大量的研究表明，CBX2 在肿瘤的发生、发展及预后中发挥着重要作用，但是关于 CBX2 在膀胱癌中的作用尚未完全清楚[16]。因此，我们采用临床大样本数据库从CBX2基因在正常组织与膀胱癌中的表达、与膀胱癌临床病理特征的相关性、与膀胱癌预后的相关性等方面，全面评估了CBX2在膀胱癌诊断与预后中的重要作用[3,17]。我们的分析结果提示 CBX2 有望成为膀胱癌治疗的一个新的药物靶点。

综上所述，本文通过对肿瘤大样本数据库进行分析，发现了了CBX2在膀胱癌中可能的发挥的生物预测作用，同时为膀胱癌提供了一个潜在的治疗靶点[1]。进一步探索 CBX2 的生物学功能及其作用机制，有可能为临床提供新的治疗手段。