表没食子儿茶素没食子酸酯可改善高脂饮食大鼠胰腺组织炎症状态

2019-07-11 07:29暴素青曹艳丽
关键词:高脂胰岛胰腺

暴素青,曹艳丽

(1天津市第一中心医院内分泌科,天津 300192;2中国医科大学附属第一医院内分泌科,沈阳 110001)

近年来,由于生活方式、饮食结构改变,肥胖的患病率越来越高[1]。研究表明[2-6],肥胖相关的胰岛素抵抗是一种慢性低度炎症性疾病,在胰腺组织中表现为巨噬细胞浸润增加,激活炎症信号通路,抑制胰岛素信号通路,随着胰岛β细胞破坏增多,最终出现高血糖状态[2-6]。在II型糖尿病中,促炎细胞因子介导β细胞功能紊乱是糖尿病的特征性改变,而影响β细胞功能的促炎因子包括c-反应蛋白、细胞因子(如IL-1β,IL-6,TNF-α等)及趋化因子(如单核细胞趋化因子1,IL-8等)[7]。这些促炎因子可通过NF-κB信号通路,影响胰岛素受体底物1与2磷酸化水平,使丝氨酸磷酸化增多,进而影响胰岛素信号传导[8]。

TLR4信号通路在肥胖个体胰腺β细胞功能紊乱中起着重要作用,其作为一种病原模式识别受体,能够识别脂类、脂蛋白及一系列内源性配体(如氧化性低密度脂蛋白等),可介导树突细胞、巨噬细胞、脂肪组织及胰腺组织中炎症因子的产生[9-12]。在高脂饮食者,血循环中游离脂肪酸(FFAs)升高,可激活TLR4/myd88信号通路,通过释放过量趋化因子,使胰岛中单核巨噬细胞浸润增多,最终促进β细胞功能紊乱的发生[13,14]。在II型糖尿病个体中,胰岛中巨噬细胞浸润增加可直接导致β细胞功能紊乱的发生[15]。

绿茶,作为一种传统饮品,其主要活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)(约占绿茶儿茶素60%),对肥胖、糖尿病、抗动脉粥样硬化等多种疾病均具有明显的药理作用[16,17]。在肥胖小鼠中,Dickinson等人报道EGCG通过清除体内过多自由基,恢复DNA修复蛋白水平,增加抗氧化酶活性,进而改善胰岛素信号传导及胰岛β细胞功能[18]。Hara等人报道,EGCG能改善离体胰岛细胞存活率,可能通过抑制8-羟基-2脱氧鸟苷的含量来实现[19]。也可抑制脂肪酶活性,抑制肥胖发生,同时可增强胰岛素受体底物2信号,改善胰岛素信号传导[20]。

EGCG是否可通过作用于TLR4信号通路,改善胰腺组织炎症状态尚未见报道。因此本研究以高脂饲料喂养建立肥胖大鼠动物模型,观察EGCG对胰腺组织TLR4炎症信号通路是否存在调节作用,并探讨相关机制。

材料与方法

1 主要试剂

小鼠单克隆抗体TLR4及CD68购自Abcam公司;山羊多克隆抗体TNF-α、IL-6及β-actin均购自Santa Cruz公司;兔抗山羊免疫球蛋白G(IgG)及兔抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)均购自北京中杉公司;全蛋白提取试剂盒购自凯基公司;RNA稳定剂(RNAlater)购于QIAGEN公司;Trizol, cDNA反转录试剂盒及SYBR Select Master Mix均购于Invitrogen公司;引物由TaKaRa (大连宝生物公司)设计并合成;免疫组织化学试剂盒购自迈新公司;胰岛素测定碘(I125)放免试剂盒购自北京原子高科公司;游离脂肪酸测定采用酶法;EGCG(纯度≥ 98%)购于Cayman公司。

2 肥胖大鼠模型建立与实验分组

SPF级健康4w龄雄性SD大鼠30只,体重85~108克,购自北京华阜康动物饲养公司。实验前适应性喂养1w后,随机分为正常饮食组(normal diet, NC,n=10)和高脂饮食组(high-fat diet,HFD,n=20)。大鼠饲养于中国医科大学动物饲养中心,每笼5只,温度控制在(22±2)℃,湿度控制在55%~60%,明暗交替周期为12h。所用饲料由实验动物中心提供。喂养期间自由摄食和摄水,每周固定时间称重,记录大鼠生长曲线。喂养16w后,普食组(NC)和高脂饮食组(HFD)大鼠体重出现明显差异,开始进入EGCG干预阶段。此实验的所有过程均按照国家卫生研究所实验动物使用规章进行。

肥胖模型建立后,将HFD组大鼠按照随机区组原则分为两组:单纯高脂饮食组(HFD,n=10)和含0.32% EGCG(相当于每200ml杯中含2g茶叶,共10杯)的高脂饮食组(HFD+EGCG,n=10),余喂养条件不变。每周监测大鼠体重及摄食量。干预16周。

3 标本采集及测定

大鼠禁食14h,称重,10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔注射麻醉,心尖取血,立即 4℃低温下3000r/min离心10min,分离血清置-80℃冰箱冻存备用。迅速取出胰腺组织,剔除血管及其他结缔组织。分两部分处理:①将组织切为长宽高均≤0.5cm,放于RNA稳定剂(RNA later)中,为下一步Real-time RT-PCR做准备;②另一部分置于冻存管后放入液氮中,过夜后移至-80℃冰箱中冻存备用。

4 生物化学分析

尾静脉采血罗氏血糖仪测定3组大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG);碘(I125)放免试剂盒测定基础胰岛素水平(fasting serum insulin,FINS),并计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance index ,HOMA-IR index):HOMA-IR= FBG(mmol/l)×FINS(mU/l)/22.5;采用酶法测定血清中游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)水平。

5 免疫组织化学

选取适当大小的胰腺组织放于冰冻切片机(Leica CM3050 S)组织托上,用OCT包埋,切片厚度约6μm,粘片,于4°丙酮中固定10min,0.01 mol/L PBS 冲洗3次×5min, 3 % H2O2淬灭内源性过氧化物酶10min,PBS冲洗3次,加一抗(CD68:1:200;TNF-α:1:100)4℃过夜,PBS冲洗3次,血清封闭10min,相应种属生物素化的二抗室温孵育30min,PBS冲洗3次,加链霉素亲和素-过氧化物酶复合体室温孵育10min。PBS冲洗3次,DAB显色1min(镜下观察确定显色时间),苏木素复染,酒精脱水、苯化,中性树胶封片。显微镜下观察,利用Image-Pro Plus 5.0 软件进行IOD值分析。

6 巨噬细胞浸润评估

采用CD68免疫组织化学染色标记胰腺组织中巨噬细胞,每组随机选取10张不同的切片于显微镜下观察(×40高倍视野)、记数并统计分析。

7 Real-time RT-PCR检测胰腺中炎症因子表达水平

称取100mg胰腺组织,剪碎并充分匀浆,采用Trizol试剂(Invitrogen 公司)说明书抽提总RNA,应用 Tecan in finite M200 多功能酶标仪测定 RNA 纯度(纯度在1.8~2.0)及浓度,取RNA 200ng 进行逆转录(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits,Invitrogen 公司)。

目的基因和内参(GAPDH)的引物序列由 Takara公司设计并合成,序列见表1。按照SYBR@Select Master Mix试剂盒(Life technology公司)说明书,采用 Light Cycler 480荧光定量 PCR 仪进行实时定量PCR反应。反应体系 20μl,反应条件 50℃ 2min预变性,95℃ 2min变性,95℃ 15s,60℃ 1min,40循环。结果通过LightCycler480 1.5软件分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences used in real-time PCR analysis

8 Western blot检测胰腺中炎症因子蛋白水平

剪取约100mg胰腺组织依次加入适量的裂解液、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及PMSF(KGP 250 kit),匀浆(8min),匀浆后置于冰浴中30min,10000r/min离心30min,取管底清液,BCA法测定蛋白浓度,定量,加入等体的SDS-PAGE样品缓冲液,于100℃煮沸5min,放于-20℃保存备用。

待所有样品获得后加样进行SDS-PAGE蛋白电泳,其后转移至PVDF膜,用TBST洗膜(5min×3),用含5% BSA TBST缓冲液室温封闭1h,加一抗4℃过夜孵育,洗膜,加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h,洗膜,用增强型化学发光法(ECL)显色,成像检测系统(Alphaview 1.3)成像, Image-pro Plus 6.0 (IPP 6.0) 图像处理软件定量分析,以目的蛋白条带光密度与内参蛋白(β-actin)条带光密度比值作为目的蛋白相对水平。

9 统计学处理

所有统计资料用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析。数据进行正态性检验后以±SD表示。组间差异比较采用单因素ANOVA方法分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 EGCG改善高脂饮食大鼠糖代谢异常

为了评估EGCG对机体代谢改变,我们检测了EGCG处理对大鼠体重、FFAs、FBG、FINS和HOMA-IR指数及摄食量的影响。结果显示,HFD组大鼠体重、FFAs、FINS和HOMA-IR指数均明显高于NC组;EGCG处理的HFD大鼠,体重、FFAs、FINS和HOMA-IR指数显著低于HFD大鼠,与NC大鼠相近;三组大鼠FBG水平无明显统计学差异(表2)。

表2 EGCG对大鼠代谢相关指标的影响Tab. 2 Effects of EGCG on metabolic related factors in rats

2 EGCG减轻高脂饮食大鼠胰岛中炎症状态

免疫组织化学检测显示:与NC组相比,HFD组胰岛中巨噬细胞浸润明显增多,而EGCG组巨噬细胞浸润较HFD组明显减少,略多于NC组,且与NC组比较无显著性差异(图1A,图1B)。 对CD68水平的Western blot分析发现,HFD大鼠胰腺CD68水平明显上调,而EGCG处理的HFD大鼠CD68水平明显低于HFD大鼠,约为HFD组64.5%,略高于NC组,与NC组比较无显著性差异(图1C)。

对胰腺TNF-α进行免疫组织化学和Western blot检测显示,HFD组TNF-α免疫反应性明显增强,约为NC组的4倍,而EGCG干预组的TNF-α免疫反应性明显低于HFD组,约为HFD组的40%(图2)。上述结果表明,EGCG能明显抑制胰岛炎症发生,降低炎症细胞因子TNF-α水平。

3 EGCG抑制高脂饮食大鼠胰腺TNF-α和IL-6表达的上调

为了进一步评估EGCG对炎症状态的作用,我们检测了胰腺中炎症相关因子TLR4、TRAF6、TNF-α及IL-6表达。高脂饮食大鼠胰腺中TLR4、TRAF6、TNF-α及IL-6 mRNA水平明显升高,分别约为对照组的1.4倍、1.3倍、2.2倍及4.5倍(图3)。EGCG处理的HDF大鼠胰腺中TNF-α mRNA及蛋白水平较HFD大鼠均明显下降,分别约为HFD组的59.5%(图3)及65.3%(图4);EGCG处理的HDF大鼠胰腺中IL-6 mRNA及蛋白水平较HFD大鼠亦明显下降,分别为HFD组的20.5%(图3)及69.5%(图4);而EGCG处理的HFD大鼠胰腺中TLR4和 TRAF6 mRNA及蛋白水平较HFD组未见明显下降 (图3,图4)。

讨 论

本研究中,我们探讨了EGCG对高脂饮食所致胰腺组织炎症状态的作用机制。 研究结果表明,EGCG干预能抑制高脂饮食大鼠胰岛中巨噬细胞浸润和胰腺组织中TNF-α及IL-6表达的上调,这种抑制炎症的作用并非通过降低TLR4信号通路活性来实现。

图1 EGCG对高脂饮食大鼠胰岛中巨噬细胞浸润和CD68水平的影响。A,CD68免疫组织化学染色标记巨噬细胞(箭头),以苏木精复染核;比例尺,50μm;B,胰岛中每高倍视野中巨噬细胞浸润数量统计学分析;C1,胰腺CD68水平Western blot检测;C2,胰腺CD68水平统计学分析(正常组标化为 1); **, P < 0.01; *,0.01< P < 0.05; n=9Fig. 1 Effect of EGCG on in filtration of macrophage and CD68 level in the pancreas islets of the rats with high-fat diet. A, macrophages were labelled by CD68 with immunohistochemical staining (arrows), nuclei were counterstained with hematoxylin; scale bar, 50μm; B, statistical analysis for the numbers of macrophages in filtrating into the pancreas islets per high power field; C1, Western blotting for the level of CD68 in the pancreas; C2, statistical analysis for the level of CD68 (the level of NC group was normalized as 1); **, P < 0.01; *, 0.01< P < 0.05; n=9

EGCG是绿茶中主要活性成分。作为一种抗氧化剂,其可受到某些环境因素如pH值、温度、自由基水平等影响[21]。大鼠口服摄入EGCG后,进行甲基化、醛糖酸化及硫酸盐化反应,其EGCG代谢产物以上述形式存在,其中酚羟基含量决定EGCG及其代谢产物抗菌、抗动脉硬化及抗肿瘤活性[22]。

近年来,越来越多的研究集中在EGCG与肥胖方面[23-25]。在本项研究中,EGCG对高脂饮食大鼠表现出一定的抑制体重增加作用,降低血清中FFAs水平,而摄食量并未见明显改变,这些与既往一些研究报道相一致[26-27]。而基础血糖水平三组之间未见明显统计学差异,此与既往报道不一致[28],我们推测可能与饮食结构、种属(大鼠与小鼠)及摄取方式有关。EGCG干预可改善高脂大鼠HOMA-IR值,表明其可改善胰岛素敏感性,增加机体对外源性葡萄糖的代谢能力[29]。

在胰岛细胞中,由于循环中高水平的FFAs刺激炎症趋化因子(如单核细胞趋化蛋白-1,趋化因子配体-2及IL-8等)表达增多,进而募集巨噬细胞浸润增加,这些炎症状态可使胰岛β细胞功能紊乱[9,13,15]。EGCG能够逆转高糖环境中胰岛素的释放,抑制核因子-κB(NF-κB)活性,进而保护胰岛细胞免受炎症因子(IL-1β, TNF-α及IL-6等)所致的功能紊乱发生[30-32]。同时EGCG能升高循环中IL-10水平,改善葡萄糖耐量,降低糖化血红蛋白水平,进而延缓1型糖尿病的发生[33]。在本研究中,我们发现EGCG可减少高脂饮食所致肥胖大鼠胰岛中巨噬细胞浸润,抑制炎症因子如TNF-α及IL-6的表达,进一步提示EGCG减轻胰腺组织炎症的同时,能改善机体胰岛素敏感性。

TLR4作为一种重要的模式分子识别受体,能够识别多种病原相关分子,如脂多糖(LPS),多肽及类脂(尤其是饱和脂肪酸)等,激活代谢相关炎症反应的发生[34-36]。其主要通过激活TLR4/MyD88信号通路介导趋化因子的产生及增加巨噬细胞浸润程度[15]。FetA,一种肝源性的糖蛋白,可作为衔接蛋白协助FFAs激活TLR4[37]。本研究中,高脂饮食明显明显增加TLR4水平,这与既往研究报道相一致,而EGCG干预并没有明显抑制TLR4表达上调,此与既往研究报道不一致[38]。我们推测对TLR4信号通路作用可能存在剂量依赖性,或是EGCG可能通过作用于其它途径(如信号传导与转录活化子(STAT),过氧化物酶体增殖子活化受体(PPAR),或核因子κB (NF-κB)等)改善胰腺组织炎症状态[39]。因此,EGCG对胰腺组织中TLR4信号通路的影响尚需进一步研究。

图2 EGCG对高脂饮食大鼠胰岛中TNF-α水平的影响。A-C,胰腺TNF-α免疫组织化学染色(比例尺,50μm);A,NC组;B,HFD组;C,EGCG组;D,TNF-α免疫反应性统计学分析(正常组标化为1);*,0.01<P < 0.05;n=9Fig. 2 Effect of EGCG on levels of TNF-α in the pancreas islets of the rats with high-fat diet. A to C, immunohistochemical staining of TNF-α in pancreas (scale bar, 50μm); A, NC group; B, HFD group; C, EGCG group; D, statistical analysis for the immunoreactivity of TNF-α (the level of NC group was normalized as 1); *, 0.01< P< 0.05; n=9

图3 EGCG对高脂饮食大鼠胰腺中TLR4、TRAF6、TNF-α及IL-6 mRNA表达影响的实时定量PCR检测。 *,0.01<P < 0.05 vs NC组;#,0.01<P < 0.05 vs HFD 组;n=9Fig. 3 Real-time quantitative PCR detection for effect of EGCG on mRNA expression of TLR4, TRAF6, TNF-α and IL-6 in the pancreas of the rats with high-fat diet. *, 0.01<P < 0.05 vs NC group; #, 0.01<P < 0.05 vs HFD group; n=9

图4 EGCG对高脂饮食大鼠胰腺中TLR4、TNF-α及IL-6表达影响的 Western blot检测。*,0.01<P < 0.05 vs NC 组;#,0.01<P < 0.05 vs HFD 组;n=9Fig. 4 Western blotting detection for effect of EGCG on protein expression of TLR4, TNF-α and IL-6 in the pancreas of the rats with high-fat diet. *, 0.01<P < 0.05 vs NC group; #, 0.01<P < 0.05 vs HFD group; n=9

这项研究尚存在一些局限性,如仅利用单一的EGCG剂量来探索其对胰腺组织中TLR4信号通路的影响,EGCG作用可能存在剂量依赖性。而EGCG喂养组大鼠血清中EGCG浓度未进行测定,EGCG生物利用度未知,这些均可能影响本研究结果。

综上,本研究表明EGCG可改善高脂大鼠胰腺组织中炎症状态,减轻胰岛中巨噬细胞浸润,阻止胰腺β细胞功能紊乱发生,增加胰岛素敏感性。这些结果为EGCG抗炎活性分子学机制提供了一个新视角,未来还需要进一步研究来探讨不同剂量的EGCG对胰岛β细胞的功能的作用。

猜你喜欢
高脂胰岛胰腺
临床胰岛制备研究进展
《中华胰腺病杂志》稿约
高脂血标本对临床检验项目的干扰及消除对策
CT,MRI诊断急性胰腺炎胰腺内外病变价值比较
怀孕期间母亲高脂饮食可能影响婴儿肠道的微生物组
18F-FDG PET/CT显像对胰腺良恶性病变的诊断价值
1型糖尿病小鼠胰岛微血管内皮细胞超微结构受损
高脂饮食诱导大鼠生精功能障碍
非编码RNA在胰岛发育和胰岛功能中的作用
味精与高脂日粮对生长猪胴体性状与组成的影响