T细胞、BCL-2、BAX对重型再生障碍性贫血患者异基因造血干细胞移植术后感染的临床意义分析

张彦 万佳

再生障碍性贫血为血液系统重症疾病之一，其因获得性骨髓造血功能衰竭，致机体全血细胞减少，主要以红细胞、粒细胞和血小板减少所引起的贫血、感染和出血为特征。再生障碍性贫血临床预后较差，多数患者死于感染或者出血等并发症，尤其是重型再生障碍性贫血患者[1]。研究发现，采用常规治疗再生障碍性贫血的效果不佳，强化免疫抑制治疗，虽然再生障碍性贫血的缓解率显著上升，但仍有30%左右患者治疗无效，甚至死亡[2]。近年研究发现，异基因造血干细胞移植术治疗重型再生障碍性贫血的效果较好，可有效恢复患者造血功能，降低患者病死率，但术后发生感染的风险仍较高，严重影响移植的治疗效果[3]。研究发现，再生障碍性贫血患者伴有不同程度免疫功能缺陷[4]。而重型再生障碍性贫血患者异基因造血干细胞移植发生感染后，进一步影响机体免疫功能，有学者认为，免疫功能紊乱与细胞凋亡密切相关，包括BCL-2蛋白、BAX蛋白、caspase蛋白等被激活，表达上调有关[5]。因此，探究T细胞计数、BCL-2、BAX蛋白表达在重型再生障碍性贫血患者异基因造血干细胞移植术后感染患者表达及意义，为临床了解细胞免疫与细胞凋亡间的关系提供一定的理论依据。具体报道如下。

资料与方法

一、临床资料

本次研究经过西南医院伦理委员会审批。纳入标准：（1）符合《再生障碍性贫血诊断治疗专家共识（2010年版）》[6]中重型再生障碍性贫血诊断标准（需至少满足以下其中2项指标：网织红细胞＜ 1%，绝对计数＜ 15×109个/L；中性粒细胞绝对计数＜0.5×109个/L；血小板 ＜ 20×109个/L）；（2）无其他血液系统及免疫疾病；（3）入组者均签订知情同意书。排除标准：（1）入组前1周服用皮质类固醇激素、免疫抑制剂；（2）拒绝入组研究者。根据纳入排除标准，选择西南医院2014年1月至2018年1月收治的52例重型再生障碍性贫血异基因造血干细胞移植患者作为研究对象，依据干细胞移植是否发生感染（诊断标准：术后1个月内发生的各种感染；有明确感染病灶；感染相关部位微生物培养阳性；患者至少有以下一种症状或体征；反复发热（体温 ＞38.5℃或持续时间超过24 h、寒战）分为未发生感染组（32例）、感染组（20例）。两组研究中一般资料比较差异无统计学意义（P＞ 0.05，表1）。

表1 再生障碍性贫血患者的一般资料

二、方法

1.干细胞移植方法：两组患者入院后均完善相关检查，明确干细胞移植适应症及禁忌症；预处理：予以兔抗人胸腺细胞球蛋白+氟达拉滨（30 mg/ m2，连用5 d）+环磷酰胺[60 mg/（kg·d），连用2 d]；移植物抗宿主病预防：全相合移植患者予以环孢素A+短程甲氨蝶呤；造血干细胞动员、采集及回输：供者予以粒细胞集落刺激因子（G-CSF）300 μg/d，皮下注射，连用4 d，第5天采集供者骨髓并回输，次日使用COBE血细胞单采机分离供者外周血干细胞后回输；并发症预防：移植前2周静滴更昔洛韦预防巨细胞病毒感染，清开灵、丹参及保肝药物预防肝静脉阻塞综合征，口服复方新诺明预防“卡氏肺孢子病”，移植前1 d开始预防性抗感染治疗，移植后白细胞最低期口服伏立康唑片，移植后7 ～ 10 d白细胞极低期联合给予静脉用丙种球蛋白，移植后定期监测巨细胞病毒复制及病原菌培养，积极静脉营养、抗感染和支持对症治疗。

2.T细胞计数检测：收集入组者清晨空腹静脉血5 ml，肝素抗凝，6 h内完成淋巴细胞表型分析；采用流式细胞仪（FACScalibur型，美国Becton Dickinson公司）对T淋巴细胞亚群进行检测，流式抗体标记样本、检测步骤严格按照说明书进行，计数成熟T淋巴细胞亚群所占细胞数百分比，总淋巴细胞（CD3+）、T 辅助细胞亚群（CD4+）、T 抑制细胞亚群（CD8+），以及T辅助细胞/T抑制细胞比值（CD4+/ CD8+）。流式细胞检测的配套试剂盒（Becton Dickinson公司）。

3.BCL-2、BAX蛋白表达检测：采用酶联免疫吸附试验检测BCL-2、BAX蛋白表达情况；收集入组者清晨空腹静脉血5 ml，9 000×g离心10 min后获得血清，放入-20℃条件下保存；取血清样本，在37 ℃条件下孵育2 h，加入BCL-2、BAX抗体，在37 ℃条件下孵育2 h，再加入底物液，在37 ℃条件下孵育30 min，测定OD值。酶联免疫吸附试验试剂盒由Ogema公司提供，操作严格按照说明书执行。

4.随访：采用电话、门诊对入组患者进行随访，随访时间为12个月，记录两组患者生存情况。

三、统计学分析方法

采用SPSS19.0软件进行数据处理，性别、移植术后感染发生情况采用[n（%）]表示，用c2检验比较差异；年龄、身体质量指数、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、BCL-2、BAX、BCL-2/BAX 采用表示，采用卡方检验比较两组患者生存率；采用Pearson 相关性检验分析CD4+/CD8+值与BCL-2/BAX 值相关性。符合正态分布计量资料，比较采用t检验，非正态分布计量资料采用秩和检验，以P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.异基因造血干细胞移植后感染与移植类型之间的关系：人组织相容性抗原配型：全相合31例，其中12例（38.71%）发生感染；不全相合21例，其中8例（38.10%）发生感染，不同人组织相容性抗原配型干细胞移植术后感染发生率比较差异无统计学意义（c2= 1.3064，P= 0.3427）。供者来源：同胞间移植39例，其中14例（35.90%）发生感染；供者为父母单倍型移植11例，其中5例（48.45%）发生感染；中国骨髓库提供非血缘全相合移植2例，其中1例（50.00%）发生感染；不同供者来源干细胞移植术后感染发生率比较差异无统计学（c2=2.4625，P= 0.0722）。两组患者干细胞移植术后均为发生移植物抗宿主反应。

2.两组患者外周血T细胞亚群检测情况：未感染组患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平高于感染组，CD8+水平低于感染组，差异具有统计学意义（P＜ 0.05，表2）。

3.两组患者BCL-2、BAX蛋白表达情况：未感染组患者外周血BCL-2蛋白表达水平及BCL-2/ BAX值高于感染组，BAX蛋白表达水平低于感染组，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05，表3）。

4.CD4+/CD8+值与BCL-2/BAX值的相关性：采用Pearson相关性检验分析CD4+/CD8+值与BCL-2/BAX值相关性，结果发现重型再生障碍性贫血患者异基因造血干细胞移植后CD4+/CD8+值与BCL-2/BAX 值呈现正相关（r= 0.620，P＜ 0.001，图1）。

表2 两组SAA患者外周血T细胞亚群检测情况（±s，个/μl）

表2 两组SAA患者外周血T细胞亚群检测情况（±s，个/μl）

分组 例数 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+未感染组 32 79.09±15.40 128.78±24.36 74.17±5.48 1.68±0.15感染组 20 57.62±10.36 86.17±11.22 76.79±4.36 1.15±0.10 t 值 5.107 3.626 3.260 8.311 P值 0.009 0.024 0.031 ＜0.001

表3 两组SAA患者BCL-2、BAX蛋白表达情况（±s）

表3 两组SAA患者BCL-2、BAX蛋白表达情况（±s）

分组 例数 BCL-2 BAX BCL-2/BAX未感染组 32 0.48±0.10 0.33±0.04 1.07±0.06感染组 20 0.34±0.07 0.41±0.12 0.83±0.04 t 值 5.394 4.605 6.032 P值 0.008 0.013 0.005

5.随访结果：对入组患者随访6 ～ 12个月（本次研究因前期纳入患者临床资料收集不全，所纳入病例数仅有23例随访时间超过1年，因而界定随访时间为1年）；非感染组患者1年生存率为90.63%（29/32），感染组患者1年生存率为50.00%（10/20），两组患者生存率比较差异具有统计学意义（c2=6.2184，P= 0.0064）。生存曲线图见图2。

图1 重型再生障碍性贫血CD4+/CD8+值与BCL-2/BAX值的相关性

图2 两组患者1年随访生存情况

讨 论

重型再生障碍性贫血是一种由T淋巴细胞介导的、损伤骨髓的疾病。既往研究认为，再生障碍性贫血是由不明原因，如氯霉素、放射线和病毒感染等，引起的造血功能衰竭[7]。随着免疫学、分子生物学的发展，研究发现[8-10]，再生障碍性贫血的发病机制与造血干细胞功能丧失密切相关，导致患者骨髓的总体集落形成能力下降；由多种致病因素导致造血微环境功能缺陷，损伤造血干（祖）细胞及基质细胞受损；再生障碍性贫血患者多伴有免疫功能异常，机体免疫异常，可损伤造血干细胞，并占着主导作用；遗传因素，部分再生障碍性贫血患者对于某些致病因素的敏感性较高，进而增加再生障碍性贫血发生风险。

目前临床中再生障碍性贫血的治疗主要包括支持治疗、病因治疗，支持治疗主要以预防和治疗血细胞减少所引起的并发症为目的；病因治疗主要以补充和替代数量减少和受损的造血干细胞为目的，避免损害进一步加重，尽可能恢复受损的造血干细胞功能，如异基因造血干细胞移植、免疫抑制治疗等[11-12]。异基因造血干细胞移植是在大剂量放化疗处理基础上，清除患者体内肿瘤或异常细胞后，将异基因造血干细胞移植给患者，重建患者正常造血及免疫系统。目前异基因造血干细胞移植是治疗重型再生障碍性贫血的主要策略之一，不仅可延长患者生存期，且治疗反应稳定，克隆性疾病发生风险低，患者生活质量显著提高[13-14]。但是重型再生障碍性贫血患者异基因造血干细胞移植后伴有继发感染风险，不仅影响治疗效果，同时影响患者机体免疫功能，严重者可死亡[15]。本次研究结果显示，入组52 例重型再生障碍性患者，异基因造血干细胞移植术后感染发生率为38.46%，术后感染发生率较高，并且影响患者生存期。另外，在干细胞移植过程中应用抗生素，不仅可降低感染发生风险，同时利于移植后患者免疫功能恢复。干细胞移植后并发感染具有一定特殊性及复杂性，其临床表现不典型，病原菌培养阳性率低，感染病灶不明确，但并发感染患者病情进展速度快、病死率高，因此，降低患者异基因造血干细胞移植术后感染发生率，具有重要意义。

T淋巴细胞包括T辅助细胞亚群（CD4+）、T抑制细胞亚群（CD8+），正常情况下，机体T淋巴细胞总数CD3+/CD4+值较为稳定，当T淋巴细胞亚群数量及比值出现变化时，提示机体免疫功能出现紊乱。通过检测外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞，可反映机体免疫功能，进而对机体感染进行辅助诊断[16]。黎伟超等[17]研究发现，CD4+、CD4+/ CD8+值降低，与恶性肿瘤的发生、病毒感染密切相关，CD8+参与机体细菌及病毒的清除，其水平升高，提示机体存在细菌或真菌感染。本次研究结果发现，未感染组患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+水平高于感染组，CD8+水平低于感染组，结果说明异基因造血干细胞移植术后发生感染，进一步损伤免疫功能，进而影响患者术后造血功能的重建。

研究发现[18]，BCL-2蛋白可抑制细胞程序性死亡，参与细胞线粒体、核孔复合体信号的传递；并且能够改变线粒体外模通透性，调节细胞凋亡因子的释放；另外，BCL-2还可影响钠钾泵功能，减少因辐射所引起的细胞凋亡。BAX蛋白为一种促凋亡蛋白，为BCL-2蛋白家族中成员之一，其可过度表达拮抗BCL-2的保护作用，促进细胞凋亡[19]。Vervloessem等[20]研究发现，细胞的凋亡与BCL-2/ BAX值密切相关，BCL-2/BAX值升高，提示细胞凋亡受到抑制。本次研究发现，未感染组患者外周血BCL-2蛋白表达水平及BCL-2/BAX值高于感染组，BAX蛋白表达水平低于感染组，Pearson相关性检验分析发现重型再生障碍性贫血患者异基因造血干细胞移植后CD4+/CD8+值与BCL-2/BAX值呈现正相关；结果说明，异基因造血干细胞移植术后感染可能参与调节细胞凋亡，促进相关凋亡蛋白表达，加速免疫细胞凋亡。

综上所述，重型再生障碍性贫血异基因造血干细胞移植术后发生感染，导致患者免疫功能异常，可能与细胞凋亡蛋白BCL-2表达上调有关，且术后发生感染显著缩短患者生存期，因此，可通过评估SAA患者T细胞水平，BCL-2、BAX蛋白表达情况，评估患者预后。但本次研究主要回顾性分析临床资料，关于免疫功能与BCL-2、BAX蛋白间的关系尚不明确，需后续进一步研究证实。