健康断奶仔猪携带猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行病学调查

饶继红 何彪 涂长春 张家宁 葛淑敏 龚文杰

摘要 为进一步了解我国规模化猪场健康断奶仔猪携带猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的情况，对2017年采自我国25个省（市）38个规模化猪场的断奶仔猪咽拭子、肛拭子、血清共4 059份样品进行了高通量测序，然后对检测到的病毒进行RT-PCR或PCR验证。基于高通量测序的宏基因组学结果显示，健康断奶仔猪的咽拭子、肛拭子、血清中共出现1 706条动脉炎病毒科的病毒基因Reads，其中包括PRRSV。通过RT-PCR扩增从咽拭子和肛拭子中共检测出46个PRRSV样品，样品阳性率为1.1%，猪场阳性率为39.5%。同时，试验成功扩增出7个毒株的ORF5基因，并进行了序列测定。基于ORF5基因核苷酸序列的系统进化分析发现，该试验获得的PRRSV流行毒株为高致病性毒株，属于Type Ⅱ中的Subgroup 4。对健康断奶仔猪携带PRRSV的研究结果可为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供科学数据。

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）;断奶仔猪;ORF5;遗传进化分析

中图分类号 S852.65+1文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）11-0111-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.031

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract To further understand the prevalence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV） in healthy weaned piglets of pig farms in China， high throughput sequencing was carried on 4 059 samples from 38 largescale pig farms in 25 provinces （metropolitans） of China， including throat swabs， anal swabs and serum. Then the detected viruses was verified by RTPCR and PCR. Based on the metagenomics results of high throughput sequencing， it was found that 1 706 arteritis virus reads appeared in throat swabs， anal swabs and serum of healthy weaned piglets， including PRRSV. RTPCR results showed that 46 samples were PRRSV positive in throat swabs and anal swabs， the individual positive rate was 1.1% and the herd positive rate was 39.5%. In addition， ORF5 genes of 7 strains were amplified and sequenced. Phylogenetic analysis based on the nucleotide sequences of ORF5 genes showed that the sequenced PRRS viruses belonging to subgroup 4 of Type Ⅱ are closely related to highly pathogenic PRRSV. This study provided scientific basis for the prevention and control of PRRS in China.

Key words Porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）;Weaned piglets;ORF5;Phylogenetic analysis

基金项目 “十三五”国家重点研发计划项目（2017YFD0500104）。

作者简介 饶继红（1993—），女，广东韶关人，硕士研究生，研究方向：动物病毒学。

通信作者：葛淑敏，副教授，博士，硕士生导师，从事生物检测、单克隆抗体制备及特异性菌种筛选等研发工作;龚文杰，副研究员，博士，硕士生导师，从事动物病毒学的预防控制研究。

收稿日期 2018-12-25

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是严重危害养猪业的重大传染疾病，也是世界动物卫生组织（OIE）必须上报的动物疫病之一[1-2]。PRRSV属于套式病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属（Arterivirus）[3-5]，其基因组大小约为15 kb，由9个重叠的开放阅读框组成。PRRSV是具有囊膜的单股正链RNA病毒，包括8个开放阅读框（ORFs），其中ORF1编码的蛋白与RNA 复制和转录相关，非结构蛋白Nsp2基因位于ORF1区，ORF5编码重要的保护性抗原糖蛋白GP5。Nsp2和ORF5在PRRSV基因組中变异最大，是科学工作者研究PRRSV分子流行病学及其遗传衍化规律常用的基因片段[6]。

PRRSV在美国已经流行了30多年，在我国也流行了20余年，它仍然是危害世界养猪业的重要病原体之一[7]。2006年，在我国高致病性PRRSV的暴发直接导致了200多万头猪死亡[8]。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）具有高致病性和传染性等特点，一旦传播就会给我国乃至全世界的养猪业造成巨大的经济损失。自2013年以来，由新的PRRSV变异株NADC30-like引起PRRV在我国的再次流行[9-10]。Guo等[11]系统分析了我国PRRSV的流行状况，阐明了PRRSV-1和PRRSV-2在我国的流行情况。

断奶仔猪处于一个较敏感的阶段，断奶效应、中断母体抗体供应以及外在环境因素的改变都会影响断奶仔猪的免疫机能，而仔猪的免疫系统一般4～8周才比较完善[12]。虽然我国大部分规模化猪场都会对断奶仔猪进行PRRSV疫苗免疫，但健康断奶仔猪是否存在PRRSV持续性感染现象仍是值得关注的问题。为了进一步了解我国规模化猪场仔猪携带PRRSV的情况，笔者对2017年采集的国内模化猪场健康断奶仔猪样品进行PRRSV检测和遗传进化分析，旨在为有效防控PRRSV提供数据支持，促进养猪业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品信息及处理。

2017年4—5月，从25个省（市）的38个近1年来无重大疫情的规模化猪场采集1 353头日龄40～45 d且无临床症状的健康断奶仔猪的咽拭子、肛拭子和血清，共4 059份，将其分装于1 mL离心管中，加入高压灭菌过的PBS（0.02 mol/L，pH 7.4），并将其置于实验室-80 ℃冰箱中冷冻储藏，备用。

1.1.2 主要试剂与仪器。

BioFlux Simply 总RNA提取试剂盒，购自北京泰旭国际健康管理中心;2×Taq PCR Master Mix、Reverse Transcriptase M-MLV、 Random Primer，购自天根生化科技有限公司;Prime STAR Max高保真酶、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker和Agarose等试剂购自TaKaRa公司。

1.1.3 主要仪器。

无菌操作台（The BAKER COMPANY）、低温高速离心机（Eppendorf 公司）、制冰机（SANYO 公司）、PCR 仪（BioRad 公司）、电泳仪（BioRad 公司）、凝胶图像处理系统（BioRad 公司）、-25 ℃冰箱（Haier公司）。

1.2 方法

1.2.1 高通量测序及病毒宏基因组学分析。

猪场样本进行混样（5混1）后，参考He等[13]Sword of Viral Metagenomic（SVM）实验方法，进行离心取上清液、过滤、核酶消化、核酸提取、sscDNA合成、RNA降解、sscDNA纯化、dscDNA合成、寡核酸降解、单引物扩增、DNA检验，并进行SVM编号后，38个猪场共计38个SVM宏基因组数据库。由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序，并将基于高通量测序的病毒宏基因组学数据进行整理分析。

1.2.2 样品RNA提取。

将“1.1.1”中处理好的咽拭子、肛拭子、血清单样样品，分别取100 μL上清液用于RNA提取，具体试验操作步骤参考BioFlux Simply总RNA提取试剂盒说明书。

1.2.3 反转录。

反转录体系如下：总RNA 10 μL、随机引物（1 μmol）1.5 μL、Reverse Transcriptase M-MLV（200 U/μL）1 μL、dNTP Mix（10 mmol/L）1.5 μL，RRI反转录酶抑制剂（40 U/μL）0.5 μL，5×M-MLV buffer 4 μL，无RNA酶水补足20 μL。于42 ℃恒温水浴锅中孵育1 h，95 ℃酶灭活5 min，获得病毒基因组cDNA。

1.2.4 引物设计及合成。

从GenBank数据库下载各种基因型的PRRSV毒株序列，使用MEGA6.0软件在NSP2基因保守区域两端设计RT-PCR引物，上游引物PRRSV-FP為5′-CGGAAGAAACTGTCGGTG-3′，

下游引物PRRSV-RP为5′-CGCAGACAAATCCAGAGG-3′。ORF5基因扩增的引物序列参照Kang等[14]的研究报道。ORF5基因扩增的上游引物PRRSV-ORF5-FP为5′-AATGAGGTGGGCYACAACC-3′，下游引物PRRSV-ORF5-RP为5′-GCGTGACACCTTAAGGGC-3′。引物送交吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.2.5 RT-nPCR进行样品检测。

由于样品数量大，试验采用cDNA“5混1”的方法进行RT-PCR检测，将检测为阳性的混样，进一步检测单样cDNA。PCR 反应体系（25 μL）如下：2×Taq Mastermix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物PRRSV-FP 1 μL，下游引物PRRSV-RP 1 μL，cDNA模板2 μL。PCR 反应程序如下：95 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环;最后，72 ℃延伸10 min。利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并将阳性产物送交吉林省库美生物科技有限公司测序。

1.2.6 PRRSV ORF5 基因扩增及测序。

选取阳性样品cDNA，用高保真酶对ORF5基因进行RT-PCR 扩增。PCR反应条件同“1.2.5”，延伸时间改为 90 s。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR扩增为阳性的产物送至吉林省库美生物科技有限公司进行纯化及测序。

1.2.7 PRRSV ORF5 基因系统发育树及同源性分析。

利用MEGA 6.0软件分析获得的7条PRRSV ORF5基因序列，绘制系统进化树分析。此外，利用DNAStar MegAlign与GenBank上收录的PRRSV参考序列进行同源性比对分析。

2 结果与分析

2.1 宏基因组学结果

将采集来自我国25个省（市）38个规模化猪场的咽拭子、肛拭子和血清进行高通量测序后，结果发现健康断奶仔猪携带有动脉炎病毒科等病毒，其中38个SVM宏基因组中有16个SVM宏基因组表出现动脉炎病毒科病毒病毒基因片段，共1 706条Reads（表1）。

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