外源H2S对货架及低温下采后草莓果实抗氧化活性的影响

李小娟,李明笑,聂钰洪,周晓微,张 蓓,李 萌,*

(1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院,河南郑州 450002;2.河南省口岸食品检验检测所,河南郑州 450003)

草莓(Fragaria×ananassaL.)因其鲜红的果面色泽,香甜气味和多汁性等特性,深受国内外广大消费者喜爱。但由于草莓果实采后易软、风味劣变、颜色暗淡和营养损失等原因,严重影响其在贮藏、运输及销售环节中品质。目前现有的草莓贮藏保鲜技术研究主要分化学、物理和生物等几大类,常见的贮藏保鲜技术有涂膜[1]、化学保鲜剂[2]、气调[3]、低温冷藏、热处理[4-5]、辐射[6]等,气调保鲜技术在应用过程中更显优势。目前已有的气调保鲜技术主要是在低温贮藏基础上,通过高浓度CO2[7]、高O2[8]、N2、NO[9]、气调包装MAP[10]、减压处理等,抑制呼吸、蒸发、酶活性及微生物作用,从而延长草莓贮藏寿命,维持草莓鲜果品质。

H2S是继一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后发现的第三种具有调控植物生理代谢作用的气体信号分子[11]。在植物中,已证实H2S能够关闭叶片气孔,减弱其呼吸作用[12-13]。已有研究发现H2S可延缓常温下草莓果实硬度下降速度,提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸还原酶(APX)以及谷胱甘肽还原酶(GR)活性,抑制多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性,下调果实衰老相关基因表达,清除体内活性氧(ROS)积累[14]。除了抗氧化酶系统以外,植物体内还存在主要由酚类物质、黄酮类物质、抗坏血酸及还原型谷胱甘肽等另一类非酶抗氧化系统[15],而该系统在草莓H2S保鲜中所起作用还未见研究。

本试验基于非酶抗氧化系统,对比在货架(20 ℃)和低温(2 ℃)贮藏过程中H2S供体NaHS对草莓果实中花青素、丙二醛(MDA)、总酚(TP)及抗氧化活性(氧化自由基吸收能力(ORAC)、DPPH自由基清除力、铁离子还原能力(FRAP)以及ABTS自由基清除能力)的影响,为其采后贮藏提供理论依据,探索NaHS作为草莓新型保鲜技术的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

‘甜查理’草莓 于2018年4月采自河南省中牟市孟庄村果园,选择大小均一、无机械损伤、无病虫害的果实,并立即运回郑州轻工业学院食品与生物工程学院实验室进行处理；硫代巴比妥酸、福林酚、没食子酸、2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、水溶性维生素E(trolox)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪、2,2′-二氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、过硫酸钾 上海Sigma-Aldrich公司;其他试剂 均为国产分析纯。

HC-3618R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;T-6型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;F-7000型荧光分光光度计 日本Hitachi公司。

1.2 实验方法

1.2.1 果实预处理 将果实随机分成5组,每组用果540个,然后将各组果实分别放入3个5 L塑料密封保鲜盒(180个果实/盒),每组保鲜盒中分别放入500 mL水(对照)、500 mL含有0.4 mmol/L NaHS、500 mL含有0.8 mmol/L NaHS、500 mL含有1.6 mmol/L NaHS和500 mL含有3.2 mmol/L NaHS的水溶液,20 ℃黑暗条件下处理24 h,将处理后的果实分别置于相对湿度为75%、20 ℃下3 d以及2 ℃下9 d,每个时间点各处理用果90个,每个重复30个。处理后的草莓果实样品直接用于花青素及丙二醛含量的测定。

将上述经过处理的各组草莓果实样品进一步冷冻粉碎处理:取草莓果实样品置入研钵,倒入液氮研磨样品,研磨棒快速研磨1 min左右,磨成粉末状,称取0.5 g粉碎样品,加入5 mL乙醇∶丙酮(7∶3,v/v)溶液,匀浆后于4 ℃下10000 r/min离心20 min,收集上清液于-20 ℃贮藏,用于总酚(TP)含量、氧化自由基吸收能力(ORAC)、DPPH自由基清除能力、铁离子还原能力(FRAP)、ABTS自由基清除能力等各项指标的测定。

1.2.2 花青素含量测定 参照Fuleki和Francis[16]测定果实中花青素含量,取0.5 g果肉加入5 mL含有10%盐酸的甲醇溶液,置于20 ℃黑暗条件下24 h,然后在4 ℃下10000 r/min离心20 min,取上清液测定530、620和650 nm处吸光度,按下式计算花青素含量:

花青素含量(μg/g)=[(A530-A620)-0.1×(A650-A620)]/46200

1.2.3 丙二醛(MDA)含量测定 参照Hodge等[17]硫代巴比妥酸法测定MDA含量,取2 g果肉加入5 mL 10%三氯乙酸溶液,4 ℃下10000 r/min离心15 min,取2 mL上清液和2 mL 0.67%硫代巴比妥酸混合,沸水浴20 min后,冰水浴5 min终止反应,测定450、532和600 nm处吸光度,按下式计算MDA含量:

MDA含量(μmol/kg)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450

1.2.4 总酚(TP)含量测定 参照Du等[18]福林酚法测定TP含量。取0.05 mL上述提取液与0.25 mol/L Folin-Ciocalteu混匀,3 min后加入1 mol/L Na2CO3反应,20 ℃黑暗条件下孵育2 h后,测定765 nm处吸光度,根据没食子酸绘制标准曲线,所得回归方程为y=6.8393x+0.0081,R2=0.9775。没食子酸标准品溶液在0～0.08 mg浓度范围,计算TP含量。

1.2.5 氧化自由基吸收能力(ORAC)测定 参照Thaipong等[19]方法,根据草莓果实ORAC测定预实验结果,将上清液稀释20倍,取25 μL稀释液与63 nmol/L荧光素和6 mmol/L 2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐混合,用荧光分光光度计测定,激发波长485 nm,发射波长520 nm,根据trolox绘制标准曲线,所得回归方程为y=6.9447x+11.722,R2=0.9583。trolox标准品溶液在0～3.5 μmol浓度范围,计算ORAC氧化自由基吸收能力。

1.2.6 DPPH自由基清除能力测定 参照Peter等[20]方法,取20 μL稀释液与62.5 μmol/L DPPH混合,37 ℃暗反应30 min,冷却至室温后,在517 nm处测定吸光度,根据trolox绘制标准曲线,所得回归方程为y=14.63x-0.0161,R2=0.9345。trolox标准品溶液在0～0.08 μmol浓度范围,计算DPPH自由基清除能力。

1.2.7 铁离子还原能力(FRAP)测定 参照Peter等[20]方法,取75 μL稀释液与反应液(反应液组成:250 mmol/L 醋酸缓冲液,8.3 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪,16.7 mmol/L FeCl3,按体积比10∶1∶1混合)混合,37 ℃暗反应10 min,冷却至室温后,测定在593 nm处吸光度,根据trolox绘制标准曲线,所得回归方程为y=51.672x-0.0753,R2=0.9187。trolox标准品溶液在0～0.08 μmol浓度范围,计算FRAP铁离子还原能力。

1.2.8 ABTS自由基清除能力测定 参照Peter等[20]方法,取35 μL稀释液与反应液(反应液组成:3.5 mmol/L ABTS和1.3 mmol/L过硫酸钾)混合,30 ℃暗反应2 h,冷却至室温后,在743 nm处测定吸光度,根据trolox绘制标准曲线,所得回归方程为y=0.0097x-0.0657,R2=0.937。trolox标准品溶液在0～0.2 μmol浓度范围,ABTS自由基清除能力。

1.3 数据处理

本试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析,利用Duncan’s新复极差法进行多重比较,p<0.05表示差异显著,采用Microsoft Excel 2010软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 20和2 ℃下NaHS对花青素含量的影响

草莓中花青素含量变化是其成熟的重要标志之一。由图1可以看出,无论在20 ℃还是2 ℃贮藏条件下,各处理组果实花青素含量均随贮藏时间延长而逐渐增加,但NaHS能抑制果实中花青素积累,其中3.2 mmol/L NaHS处理组果实花青素含量最低。此外,温度也是影响花青素合成的重要因素之一,利用低温延长果实寿命是国内外贮藏保鲜的主要方式,本试验发现经NaHS处理的草莓果实在低温环境下仍能有效抑制花青素合成,延缓果实衰老。Hu等[14]研究发现NaHS对草莓果实保鲜效果呈剂量依赖性,本试验同样验证了此项论断。此外,受供试品种不同的影响,NaHS最适作用剂量也发生改变。例如:‘宝娇’草莓NaHS最适应用剂量为0.8 mmol/L[14],但对于‘甜查理’，虽然0.4和0.8 mmol/L NaHS能够抑制花青素积累,但其作用效果低于1.6和3.2 mmol/L NaHS处理组。

图1 20和2 ℃贮藏条件下H2S对草莓花青素含量的影响

2.2 20和2 ℃下NaHS对MDA含量的影响

果实衰老过程中质膜过氧化产物MDA不断积累,会造成细胞膜通透性增加,严重时导致细胞膜破裂,胞内内含物外泄,因此,通过监测果实中MDA含量变化能够反映其NaHS作用效果。由图2A可以看出,相比2 ℃贮藏的果实,各处理组果实在20 ℃贮藏条件下MDA含量随贮藏时间延长迅速增加,但NaHS能够抑制MDA积累,其中1.6和3.2 mmol/L NaHS处理组果实中MDA含量从贮藏开始到贮藏后2 d一直维持在较低水平,保持果实内稳定的细胞膜通透性。从图2B可知,降低贮藏温度可延缓果实中MDA积累。此外,经不同浓度NaHS处理的果实其MDA积累明显减缓,特别是3.2 mmol/L NaHS处理组,推测可能与H2S较强的还原性有关,进入到果实内的H2S通过与清除MDA的相关酶等(如:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、氧化物酶(POD)和脂氧合酶(LOX))结合,保护较高的酶活性[14],进而清除体内多余的MDA,稳定细胞结构。

图2 20和2 ℃贮藏条件下H2S对草莓MDA含量的影响

2.3 20和2 ℃下NaHS对TP含量的影响

图3可以看出,无论在20 ℃还是2 ℃贮藏条件下,对照组果实总酚含量随贮藏时间延长无明显差异。在20 ℃贮藏3 d时,0.4 mmol/L NaHS处理未能改变草莓中总酚含量,但0.8、1.6和3.2 mmol/L NaHS处理果实总酚含量分别高于对照组果实12.92%、27.53%和11.47%。在2 ℃贮藏过程中,NaHS各处理组较对照组变化差异不显著(p>0.05),说明NaHS对酚类物质代谢调控可能受到温度的影响,但NaHS仍能延缓果实成熟,说明草莓果实中存在其他调控机制,参与并影响果实贮藏寿命。

图3 20和2 ℃贮藏条件下H2S对草莓TP含量的影响

2.4 20和2 ℃下NaHS对ORAC的影响

为系统地分析H2S对草莓果实抗氧化活性的影响,本试验对ORAC、DPPH自由基清除力、FRAP以及ABTS自由基清除能力进行分析。由图4A和B可以看出,在20 ℃和2 ℃贮藏过程中,处理组与对照组果实中ORAC均随贮藏时间延长而迅速上升。20 ℃贮藏3 d以及2 ℃贮藏9 d后,0.4 mmol/L NaHS处理组果实中ORAC分别低于对照组31.68%和11.16%,但0.8、1.6和3.2 mmol/L NaHS处理组的氧自由基吸收能力显著高于对照组(p<0.05),且1.6和3.2 mmol/L NaHS处理组在整个贮藏过程中均保持较高的抗氧化活性,说明在1.6～3.2 mmol/L NaHS浓度下,NaHS有利于激活并提高果实内ORAC,进而降低果实内自由基积累。

图4 20和2 ℃贮藏条件下H2S对草莓氧自由基吸收能力的影响

2.5 20和2 ℃下NaHS对果实DPPH自由基清除力的影响

由图5A可知,从20 ℃贮藏开始到贮藏1 d后,对照组果实DPPH自由基清除力下降了18.51%,随后DPPH自由基清除力变化无明显差异。各NaHS处理组DPPH自由基清除力在整个贮藏过程中均高于对照组,其中贮藏3 d后,3.2 mmol/L NaHS处理组DPPH自由基清除力最高,1.6和0.8 mmol/L NaHS处理组次之,0.4 mmol/L NaHS处理组最低。由图5B可知,在2 ℃贮藏条件下各处理DPPH自由基清除力均呈先上升后下趋势。对照组果实在贮藏9 d后DPPH自由基清除力降低到14.76 μmol/g,而0.4、0.8、1.6和3.2 mmol/L NaHS处理组的DPPH自由基清除力分别为16.75、18.29、19.05和17.92 μmol/g,均显著高于对照处理组(p<0.05),表明NaHS能够稳定果实DPPH自由基清除力。

图5 20和2 ℃贮藏条件下H2S对草莓DPPH自由基清除力的影响

2.6 20和2 ℃下NaHS对果实FRAP的影响

由图6可知,在20 ℃贮藏过程中对照组FRAP随贮藏时间延长逐渐下降,而经NaHS处理的果实中FRAP均呈上升趋势,且在贮藏2 d后达到高峰随后下降,其中3.2 mmol/L NaHS处理组果实FRAP在贮藏第2 d最高,高于对照组73.68%。在2 ℃贮藏过程中,各处理组FRAP均随贮藏时间延长逐渐下降,贮藏9 d后0.4、0.8、1.6和3.2 mmol/L NaHS处理组分别高于对照组10.67%、11.37%、12.89%和18.02%。上述结果表明,NaHS可激活20 ℃贮藏下果实内FRAP,提高其抗氧化活性,但在2 ℃下NaHS对FRAP的激活作用明显均减弱。

图6 20和2 ℃贮藏条件下H2S对草莓铁离子还原能力的影响

2.7 20和2 ℃下NaHS对ABTS自由基清除能力的影响

由图7可知,在20或2 ℃贮藏过程中,各处理组ABTS自由基清除能力均随贮藏时间延长呈下降趋势。对照组ABTS自由基清除能力在20 ℃贮藏3 d后下降了33.06%,而0.4、0.8、1.6和3.2 mmol/L NaHS处理组分别下降20.66%、10.33%、12.40%和15.50%,均显著高于对照处理组(p<0.05)。在2 ℃贮藏9 d后,除0.4 mmol/L NaHS处理组保持较高的ABTS自由基清除能力,其他NaHS处理组较对照组变化差异不显著(p>0.05)。上述结果表明,NaHS能够保持20 ℃贮藏过程中较高的ABTS自由基清除能力,但在2 ℃下,NaHS对维持果实内ABTS自由基清除能力影响不显著。

图7 20和2 ℃贮藏条件下H2S对草莓ABTS自由基清除能力的影响

3 讨论与结论

目前对H2S参与调控果蔬贮藏保鲜大多处于试验阶段,主要原因是H2S自身具有毒性,且还没被任何一个国家作为食品添加剂应用于食品加工中。因此,品尝H2S处理的果实具有一定的风险性。但是,植物体中也能合成内源H2S,参与脱落酸(ABA)和过氧化氢(H2O2)信号转导、影响气孔关闭、促进种子萌发和植物根系发育、提高抗旱及金属胁迫能力、增强植物体抗病能力[13]。随着对H2S不断深入研究,研发高效、经济、无毒的H2S供体或相关衍生物产品对果蔬保鲜具有主要意义。

综上所述,在常温20 ℃和低温2 ℃贮藏条件下,NaHS均能延缓果实衰老、转色和质膜过氧化发生。在20 ℃贮藏条件下,只有当NaHS处理浓度高于0.4 mmol/L时,果实中TP含量才能显著增加(p<0.05),同时果实具有较高的ORAC、DPPH自由基清除力、FRAP以及ABTS自由基清除能力。在2 ℃贮藏条件下,NaHS对果实内TP水平和ABTS自由基清除能力无影响,却能提高果实中ORAC、DPPH自由基清除力和FRAP,尤其当NaHS处理浓度在1.6～3.2 mmol/L时效果明显。